「液-液相分離」の版間の差分

白木賢太郎

筑波大学数理物質系

英: liquid-liquid phase separation<br>

　液-液相分離とは、単一の均質な液体が、特定の条件下で二つの異なる液相に分かれ、それらが共存する現象を指す。液-液相分離によって成分の濃度が異なる二つの相が形成されるが、それぞれの相の成分は内部でよく混ざり、液体の性質を示すことが特徴である。液-液相分離は材料科学や化学工業の分野で研究されてきた現象であったが、2015年頃から生命科学において研究が盛んになっている<ref name=Molliex2015><pubmed>26406374</pubmed></ref><ref name=Nott2015><pubmed>25747659</pubmed></ref><ref name=Brangwynne2013><pubmed>24368804</pubmed></ref>[1-3]。

　細胞内の構造は、主に[[脂質二重層]]によって形成される[[オルガネラ]]（[[ミトコンドリア]]、[[リソソーム]]、[[ゴルジ体]]など）であると考えられていた。しかし、[[細胞質]]や[[細胞核]]内には膜を持たない細胞内構造（membrane-less organelles, MLOs）が多数存在するという見方が広がり、それらの形成メカニズムの解明が求められていた。その契機となったのは、2009年の[[w:Anthony A. Hyman|Anthony Hyman]]の研究チームの[[wj:クリフォード・ブラングウィン|Clifford Brangwynne]]らによる論文であった<ref name=Brangwynne2009><pubmed>19460965</pubmed></ref>[4]。彼らは[[線虫]]の[[生殖細胞]]に存在する[[P顆粒]]が流動性を持った液体であることを報告した。P顆粒が液-液相分離によって形成されることを指摘し、液-液相分離が物質の動的な区画化の仕組みとして重要な役割を担っていることが示唆された。

　2011年にはBrangwynneらが、[[核小体]]が液-液相分離によって形成されることを報告し、多くの生体分子凝集体が液-液相分離の原理によって制御されていることが示唆された<ref name=Brangwynne2011><pubmed>21368180</pubmed></ref>[5]。2012年には、米国テキサス大学サウスウェスタン・メディカルセンターに所属するMichael Rosenらの研究チームによるネイチャー誌への論文や<ref name=Li2012><pubmed>22398450</pubmed></ref>[6]、[[w:Steven McKnight|Steven McKnight]]らの研究チームによるセル誌への論文が<ref name=Kato2012><pubmed>22579281</pubmed></ref>[7]、タンパク質の液滴に関する報告しており、これらの報告をきかっけに液-液相分離が細胞内の機能の基本原理として認識されるようになった。

　生命科学の分野では、[[ストレス顆粒]]や[[生殖顆粒]]、核小体などのMLOsが液-液相分離によるものであるとされている<ref name=Brangwynne2013 /> [3]。しかし、このような名前が付けられている明確な細胞内構造物だけでなく、一時的に形成されるもっと小さな液-液相分離による集合物も存在するとされ、細胞内でのタンパク質の動的な振る舞いを統合するメカニズムとして注目されている<ref name=Banani2017><pubmed>28225081</pubmed></ref>[8]。また、異常な液-液相分離がタンパク質凝集を引き起こし、[[筋萎縮性側索硬化症]]や[[パーキンソン病]]などの[[神経変性疾患]]の原因となる可能性が示唆されている<ref name=Shin2017><pubmed>28935776</pubmed></ref>[9]。

　異なる親水性を持った2種類の高分子（例えば、[[ポリエチレングリコール]]と[[デキストラン]]）の溶液を混合したときにも液-液相分離が生じる。高分子の溶液を混合したときに生じる液-液相分離は、[[水性二相系]]（aqueous two-phase system）ということもある<ref name=Iqbal2016><pubmed>27807400</pubmed></ref>[10]。メカニズムは水と油の液-液相分離と類似しており、ポリエチレングリコールやデキストランは水にはよく溶けるが、互いにはなじまないために相分離する。[[ATP]]と[[ポリリン酸]]のように、細胞内にありふれた分子の水溶液を混合したときにも液-液相分離が生じる<ref name=Nobeyama2023><pubmed>37967197</pubmed></ref>[11]。

　2種類のタンパク質溶液を混合したときに生じる液-液相分離は、タンパク質が高濃度含まれている濃厚相と、タンパク質がほとんど含まれていない希薄相に分かれることが多い<ref name=Nobeyama2024><pubmed>37972831</pubmed></ref>[12]。濃厚相は体積が少ないため、希薄相の中に丸い形状をした濃厚相が観察できる。この丸い形状から、液-液相分離によってできた濃厚相は液滴（droplet）と呼ばれることがある（'''図1'''）。

　ATPとポリリン酸の相図の概略を'''図2B'''に示す<ref name=Nobeyama2023 /> [11]。[[カチオン]]が存在するときのATPとポリリン酸の相図は島のような形になり、島の内側はATPとポリリン酸が高濃度含まれた液滴が観察されるが、島の外側は相分離しない領域になる。相図を見ると明らかなように、ポリリン酸をある一定の濃度に固定したとき、ATPの濃度を増加させていくとある濃度以上で液-液相分離が生じて液滴が観察されるが、さらにATPを加えていくと意外にもふたたび単一相になる。ATPとポリリン酸のように、互いに親和性のある成分が相互作用して液-液相分離が生じる現象を[[会合的相分離|会合的（associative）相分離]]という。

　[[リゾチーム]]と[[オボアルブミン]]の相図の概略を図2Cに示す<ref name=Nobeyama2024 /> [12]。この相図はATPとポリリン酸の相図に似ており、リゾチームとオボアルブミンは親和性があるために液-液相分離が生じる。液-液相分離が生じたときの濃厚相には、図１にみられるように液滴のような形状になることが多い。また、低濃度のリゾチームと高濃度のオボアルブミンの領域では、液滴ではなく不定形の凝集体が観察される。タンパク質の凝集体の形成はふつう不可逆であり、イオンを加えたり温度を上げたりしても溶けないことが多い。

　相分離は他にもさまざまな種類がある。[[ブロックコポリマー]]などの高分子で見られる、ナノメートルからマイクロメートルスケールで生じる相分離を[[ミクロ相分離]]という<ref name=Leibler1980>'''Leibler, L. (1980).'''<br>Theory of microphase separation in block copolymers. Macromolecules, 13(6), 1602-1617.</ref>[13]。ミクロ相分離は通常のマクロ相分離とは異なり、完全に相分離せず、特定のナノ構造を形成するのが特徴である。

　相分離が進むときに[[粘弾性効果]]によってネットワーク状構造など異常な形態が形成されることがある。このような相分離を[[粘弾性相分離|粘弾性（Viscoelastic）相分離]]という<ref name=Tanaka2000>Tanaka, H. (2000).<br>Viscoelastic phase separation. Journal of Physics: Condensed Matter, 12(15), R207.</ref>[14]。

　液滴は流動性を持つことが特徴である。観察対象の顆粒状タンパク質集合物が液滴であるかを判別するには、接触時に融合するかどうかを確認するのが簡便である。液滴の中には、1秒もあれば完全に融合してしまうほど柔らかいものも存在する<ref name=Sakakibara2023><pubmed>37291907</pubmed></ref>[15]。一方で、接触しても融合しない場合、その集合物は液滴ではなく凝集体であると判断できる。

　液滴の流動性を定量する方法として、[[光褪色後蛍光回復法]]（[[fluorescence recovery after photobleaching]], [[FRAP]]）が広く用いられている<ref name=Sprague2005><pubmed>15695095</pubmed></ref>[16]。この手法では、液滴の一部分にレーザーを照射して蛍光を褪色させ、その後の蛍光回復速度から分子の流動性を計測する。細胞内の液滴では、蛍光の回復が秒から分のオーダーの現象として観察されることが多い。ただし、観察対象が液体の性質を持つのか、固体に近い性質を持つのかを蛍光回復の速度論的解析だけで判断するのは難しいとの見解もあり<ref name=McSwiggen2019><pubmed>31594803</pubmed></ref>[17]、慎重な解釈が求められる。

　タンパク質の液-液相分離は、分子間での静電相互作用や[[π-π相互作用]]、[[カチオン-π相互作用]]、[[疎水性相互作用]]、[[水素結合]]など多様な相互作用によって起こる。しかもタンパク質は温度などの溶液条件によって立体構造が変わることも多く、また、他のタンパク質や[[RNA]]と特異的に結合することもある。そのため、タンパク質の液-液相分離は温度やpH、塩濃度、他のタンパク質やRNAなどの存在など、多様な条件に影響を受ける。熱力学的な視点からは、[[エントロピー]]的にも[[エンタルピー]]的にも液-液相分離が駆動されるケースがある。複数のタンパク質やRNAからなる液滴は、液滴の中に液滴が形成されるようなケースもある<ref name=Lafontaine2021><pubmed>32873929</pubmed></ref>[18]。

　[[天然変性タンパク質]]（natively unfolded protein）は、明確な立体構造を持たずに柔軟なコンフォメーションをとるタンパク質のことをいう<ref name=Uversky2002><pubmed>11910019</pubmed></ref>[19]。天然変性タンパク質は本質的に無秩序なタンパク質（[[intrinsically disordered proteins]]）ということもある<ref name=Dunker2001><pubmed>11381529</pubmed></ref>[20]。タンパク質の立体構造を形成しない領域は[[天然変性領域]]（[[intrinsically disordered region]], [[IDR]]）や[[低複雑性ドメイン]]（low complexity domain）と呼ばれることがある。天然変性領域はタンパク質の液-液相分離のために機能する領域である。

　天然変性タンパク質は、[[真核生物]]の持つタンパク質に多くみられる。30残基以上の天然変性領域を持つタンパク質は、[[ヒト]]の場合、約44%と推定されている<ref name=vanderLee2014><pubmed>24773235</pubmed></ref>[21]。一方、天然変性タンパク質は[[真正細菌]]や[[アーキア]]にはあまり存在しない。

　天然変性領域は荷電残基や[[極性アミノ酸]]に富んでおり、類似した配列が繰り返し存在するのが特徴である<ref name=Chong2018><pubmed>29913160</pubmed></ref>[22]。例えば、[[フェニルアラニン]]と[[グリシン]]が繰り返し現れる[[FGリピート]]や、[[アルギニン]]とグリシンが繰り返し現れる[[RGGリピート]]などのモチーフが知られている。天然変性タンパク質にはRNA結合ドメインを持っているものも多く、RNAと共に液-液相分離を形成するものがある。

　細胞に[[酸素]]が不足すると、真核細胞では[[酸化的リン酸化]]経路によるATP合成ができなくなる。その結果、[[META body]]と呼ばれる代謝酵素の集合体が形成されることが2013年に報告されている<ref name=三浦2024>三浦夏子. (2024)<br>出芽酵母で形成される解糖系酵素群の集合体とその制御. 化学と生物 Vol. 62, No. 4</ref> [23]。META bodyは[[解糖系]]（glycolysis）に関与する酵素群によって形成されるという意味で[[グリコリティック体]]（[[G-body]]）と呼ばれることもある。G-bodyにはRNAも含まれており、「膜のないオルガネラ」としての性質を備えている<ref name=Fuller2020><pubmed>32298230</pubmed></ref>[24]。

　液-液相分離は、細胞生理学としての役割だけでなく、異常なタンパク質凝集を引き起こし、筋萎縮性側索硬化症やパーキンソン病、[[アルツハイマー病]]、[[ポリグルタミン病]]、[[プリオン病]]などの神経変性疾患に関与することが示され、医学的な観点からも重要な研究テーマとなっている<ref name=Ahmad2022><pubmed>35998851</pubmed></ref>[25]。特に、[[TDP-43]]や[[FUS]]などのタンパク質が液-液相分離を形成した後、異常な凝集体を形成し、病態につながることが示唆されている<ref name=Patel2015><pubmed>26317470</pubmed></ref>[26]。

　シナプスタンパク質による液-液相分離は、[[長期増強]]現象のメカニズムとして近年注目されている<ref name=Hayashi2021><pubmed>33472825</pubmed></ref><ref name=林2021>林 康紀，細川 智永，劉 品吾，實吉 岳郎. (2021).<br> CaMKII の新しいシナプス可塑性機構. 生化学　第93 巻第2 号，pp. 191-202</ref>[27, 28]。[[Ca2+/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII|Ca²⁺/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼII]]（[[CaMKII]]）は、[[記憶]]現象に必須の働きを持つキナーゼである。CaMKIIは神経細胞内に多量に発現しており、[[シナプス後膜肥厚]]では全タンパク質の10%から20%を占めるほどになる。このキナーゼがなぜこれほど多量に存在する必要があるのかは、長年の謎として残されていた。林康紀らの研究チームは、CaMKIIが[[NMDA型グルタミン酸受容体]]と液滴を形成することで、[[AMPA型グルタミン酸受容体]]を[[活性帯]]の直下に集合させ、シナプス応答を活性化する新しいメカニズムを提唱している<ref name=Hosokawa2021><pubmed>33927400</pubmed></ref>[29]。

　[[低分子量Gタンパク質]][[Ras]]の不活性化因子である[[SynGAP]]は、CaMKIIに次いでシナプス後膜肥厚に多く含まれるタンパク質である。SynGAPは、[[シナプス足場タンパク質]]である[[PSD-95]]と多価相互作用によって結合し、液-液相分離を引き起こすことが[[w:Zhang Mingjie|Mingjie Zhang]]らの研究チームによって報告されている<ref name=Zeng2016><pubmed>27565345</pubmed></ref>[30]。この液-液相分離の仕組みが、シナプス後膜肥厚からの活動依存的なSynGAPの分散のメカニズムとなっている可能性がある。

　細胞内ではDNAの修復や、遺伝子の転写、タンパク質への翻訳、シグナル伝達の制御、自然免疫の応答、機能の区画化や基質の貯蔵、環境の変化への応答など、生命科学においても重要な機能が液-液相分離と関連していることが2019年頃までに次々に明らかにされてきてきた<ref name=Fiddian-Green1975><pubmed>2019</pubmed></ref>[31]。その結果、翻訳後修飾のようにごくわずかな化学修飾がなぜ遺伝子の転写などの生命現象を引き起こすのか、なぜ危険なプリオンが種を超えて存在しているのか、固有の構造を形成しない天然変性領域を持つ天然変性タンパク質がなぜこれだけたくさん存在するのか、細胞内にはATPがなぜmMのオーダーで存在しているのか、代謝の連続的な反応はどのように生じるのかなど、分子を研究するだけでは理解が困難だった現象に対して解答を与えられるようになった<ref name=Fiddian-Green1975 /> [31]。

　これから生命科学の液-液相分離の研究を進めるにあたり、計測機器の発展と、既存の理論との整合が期待される<ref name=Gardos1976><pubmed>2021</pubmed></ref>[32]。これまでの生命科学は、分子を対象とした研究が主流であり、タンパク質の立体構造を高精度に測定し、どのような分子種が細胞内に存在するのかを網羅的に分析するという手法が発達してきた。一方、今後は分子集合物をターゲットにした計測手法や、細胞の中にある分子の非破壊での計測手法の開発が期待されている。現在、細胞内の液-液相分離の研究で最も広く使われている計測技術は、蛍光タンパク質ラベルによる超高解像度蛍光顕微鏡での観察だが、非染色・非破壊で計測できるラマン散乱法や赤外分光法などの計測技術の技術革新が期待される。

　また、天然変性領域を持つタンパク質が液-液相分離を引き起こしやすいが、天然変性領域を持たない２種類のタンパク質を常識的な溶液条件で混合するだけでも液-液相分離が起こる。例えば、卵白リゾチームとオボアルブミンのようなありふれたタンパク質を、低イオン強度の条件で中性のpHで混合するだけでも液-液相分離が生じる<ref name=Iwashita2018><pubmed>30114421</pubmed></ref>[33]。細胞内には飽和濃度に近い高濃度のタンパク質が含まれているため、凝集や相分離が生じやすい環境である<ref name=Vecchi2020><pubmed>31892536</pubmed></ref>[34]。そのため、天然変性領域を持たない代謝酵素なども、細胞内では液滴を形成して機能が制御されているのだと推測できる。

　実際に試験管の中で液滴を作らせると、活性が2桁も増加する酵素が知られているが<ref name=Ura2023><pubmed>36697449</pubmed></ref>[35]、活性化しない酵素も多い。酵素の活性化や酵素の連続反応が液-液相分離とどのように関連しているのか、またそれが細胞生理学にどう結びつくのか、これから新しい視点での研究が必要になる。