「Förster共鳴エネルギー移動」の版間の差分

{{box|text=

　２つの蛍光分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へ、エネルギーが移行する。これをFörster共鳴エネルギー移動（FRET）という<ref><pubmed>22352636</pubmed></ref>。FRETの効率は２つの蛍光体のスペクトルの重なりの大きさ、距離と角度により左右される。特に、近年の緑色蛍光タンパク質（green fluorescent protein, GFP）とその色変異体や様々な蛍光スペクトルを持つ近縁のタンパク質の開発・同定により、FRETを用いて、生細胞の中の微小ドメインでのタンパク質相互作用、生化学反応や細胞内シグナル伝達の可視化が可能となった。脳神経研究においても、神経細胞、脳スライスなどの組織および個体レベルで応用されている。 }}

 

 

 

　二つの蛍光分子がごく近接して存在する場合、一つの蛍光分子からもう一つの蛍光分子へ、エネルギーが移行する事が知られている。この現象は、1946年[[wikipedia:Theodor Förster|Theodor Förster]]によって報告されたことから、Förster共鳴エネルギー移動（FRET）という<ref>'''Förster, T.'''<br>Energiewanderung und Fluorescenz<br>''Naturwissenscaft''. 1946, 33:166–175</ref><ref><pubmed>22352636</pubmed></ref>。かつてはFRETは、fluorescence resonance energy transferの略称として用いたが、実際には蛍光を伴わないエネルギー移動であることから、現在ではFörster resonance energy transferと呼ぶ事がIUPACにより推奨されている。

　''κ''はドナーとアクセプターの相互分子配向である。多くの場合、正確に求める事は困難であるため、しばしば''κ''² =2/3 と仮定される。この値は、両方の色素が自由に回転しており、励起状態寿命の間は等方的に配向していると考えられる場合に得られる。色素が固定されていたり自由に回転することができないような場合、''κ''² =2/3 とは仮定できない。''Q₀''はアクセプターが無い場合のドナーの蛍光[[wj:量子収率|量子収率]]、''n''は媒体の[[屈折率]]（水、25 °Cの場合、1.3342）、''N_A''は[[アボガドロ数]]である。これらの定数を当てはめると、''κ''より前の部分は、8.786 x 10¹¹ mol L^-1 cm nm²となる<ref><pubmed> 10964438</pubmed>但しこの論文にはミスプリが有り、p. 439で''κ''² とすべき所を、''κ''としている。</ref>。

　まず、ドナーの蛍光のアクセプターチャネルへの漏れ込みであり、S/N比の減少の原因となる。漏れ込みを極力抑えるには、適切なバンドパスフィルターを用いる。光量を犠牲にしても、ドナー蛍光が漏れ込まない波長を選ぶ方がFRETは特異的に検出できる。

 

　蛍光体が励起されると、図2に示すような減衰曲線に従って蛍光を発する。蛍光寿命は、蛍光の減衰曲線の速度定数''k''と逆数である。 ''N₀''は励起光によって励起された電子の数、''k''は励起状態にある電子が基底状態に戻る速度定数であり、蛍光として基底状態に戻る際の速度定数、熱を発して基底状態に戻るなどの無放射遷移の速度定数の和として表される。

　ここで、''k_D''はドナーの蛍光の速度定数、''Q_D''はドナーの蛍光の量子収率、''&kappa;''はドナーとアクセプターの双極子モーメントの配向、''r''はドナーとアクセプターの距離、''N_A''はアボガドロ数、''n''は溶媒の屈折率である。

　励起光によって発生した一つ一つの光子が検出器まで届くまでの時間(数nsec)を計測することで時定数&tau;を計算する。時間を横軸としてヒストグラムを作製することができる。通常蛍光寿命は指数関数に従い減衰していく。FRETを起こしている分子と起こしていない分子が共存する時には二重指数関数になるため、二重指数関数にfittingすることによって、FRETの起きている分子の割合が算出できる。得られる光子の数が少ない時には二重指数関数fittingは不正確になりやすい為、単に平均蛍光寿命を計算するだけで済ませる場合も有る。単一指数関数の場合は、平均蛍光寿命は&tau;に等しくなる。

 

[[Image:FRET-図4.jpg|thumb|right|300px|<b>図4:海馬スライスCA1錐体細胞に発現させたGFPのFLIMイメージおよび減衰曲線</b><br>（横軸は時間、縦軸は光子数）をBecker＆Hickl社software、SPC imageにて取得した。実際には、20秒で数千個オーダーの光子を取得する。これらの光子の発生確率分布が減衰曲線を形成し、近似曲線をフィッティングさせることで蛍光寿命を取得する。]]

　一つの蛍光団のストークスシフトが小さい場合、励起スペクトルと蛍光スペクトルの重なりが大きいような蛍光団では、同一の蛍光団同士で、[[wikipedia:Homo-FRET|Homo-FRET]]が生じる。Homo-FRETは、蛍光強度および蛍光寿命は変化しないが、異方性が変わる。この原理を用いて、一般的には、分子同士のクラスターの度合いなどに応用されている。

[[ファイル:FRET Probes.png|thumb|right|350px|'''図5. 様々なフレットプローブの類型'''<br>]]

　この原理は、FRETプローブの最も初期に導入されたデザインである(図6A)。例として、[[wj:第X因子|第X因子]]などのプロテアーゼが挙げられ<ref><pubmed>8707050</pubmed></ref>、[[wikipedia:ja:プロテアーゼ|プロテアーゼ]]によって分解される配列の両端にドナーとアクセプターを連結する。プロテアーゼによって、この配列が分解されるとドナーとアクセプターの間に起きていたFRETが解消されることによって、プロテアーゼの活性を評価する。[[wikipedia:ja:カスパーゼ|カスパーゼ]]などの活性を測定するためにも使用されている<ref><pubmed>9518501</pubmed></ref><ref><pubmed>12409609</pubmed></ref><ref><pubmed>21637712</pubmed></ref><ref><pubmed>17946841</pubmed></ref>。このプローブのデザインの短所としては、反応が不可逆的であるために、一つの実験系で何度も測定することが困難であることである。

　興味のあるタンパク質同士の相互作用を測定する際に、この原理が用いられる。一方にドナー、他方にアクセプターを連結する。タンパク質同士が結合していないときにはFRETは起きていないが、結合することによってFRETを生じる。応用例としては蛍光寿命を基にした[[Gタンパク質]]の活性化の測定に用いられている<ref><pubmed>11429608</pubmed></ref>。また、[[アクチン]]の重合度を測定するために、アクチンにドナー、アクセプターを連結して測定している例もある<ref><pubmed>15361876</pubmed></ref>。 距離のファクターを生かせるために、比較的大きなシグナルが得られる一方、内在性のタンパク質が反応に関与するために、その分FRET応答が減少する。ドナーとアクセプターの発現量の差によるFRETの応答の変化も問題になる。特に、アクセプターと結合しないドナーが多量に存在するとFRET応答が小さくなる。一般にアクセプターが多い系が、使用に適している。

====タンパク質の構造変化を基にしたFRETプローブ====

　興味のあるタンパク質が、活性化の際に構造変化を誘起することが知られている場合には構造変化を利用することができる。タンパク質のC末およびN末にドナーおよびアクセプターを連結する。この手法は、[[CaMKII]]<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>、[[Calcinulin]]<ref><pubmed>18493642</pubmed></ref>、[[raf]]<ref><pubmed>15711535</pubmed></ref><ref><pubmed>16858395</pubmed></ref>、[[膜電位]]測定<ref><pubmed>18622396</pubmed></ref>、などに用いられている。

====タンパク質結合に伴う構造変化を基にしたFRETプローブ====

　ある種のタンパク質は活性化、非活性化に伴い、下流のタンパク質と結合する。このような相互作用を利用してタンパク質の活性化、非活性化を測定することができる。例えば[[カルシウム]]FRETプローブ、カメレオンはこの原理を利用している<ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>。 また、[[低分子Gタンパク質]]の活性化プローブは、低分子Gタンパク質、シグナル伝達下流の結合タンパク質の結合ドメインをドナーとアクセプターで挟んだ形状をしている。低分子Gタンパク質が[[GDP]]から[[GTP]]結合型になり活性化すると、結合ドメインと相互作用をしFRETが生じる<ref><pubmed>16429133</pubmed></ref>。  

====共有結合修飾によって生じる構造変化を測定するプローブ====

　このプローブは、ドナー、アクセプター、[[wikipedia:ja:共有結合|共有結合]]修飾を受けるドメイン、これを認識するドメインからなる。プローブが共有結合修飾を受けると、認識するドメインが結合し、ドナーとアクセプターの距離が縮まりFRETが起きる。このプローブは、キナーゼの活性化を測定するために使用される<ref><pubmed>11875431</pubmed></ref><ref><pubmed>11752449</pubmed></ref>。

====生体膜上の小分子を測定するFRETプローブ====

　このプローブは、主に、[[wikipedia:ja:脂質|脂質]]分子に応用されてきた。ドナー、脂質結合ドメイン、アクセプターが堅いヘリックス構造で連結され、[[グリシン]]グリシン配列をその途中に導入することで、そこを中心に一方の蛍光タンパク質が回転することができる。膜結合ドメインを用いて、プローブを結合させる。脂質分子が増えた際に、脂質結合ドメインが脂質分子を認識し、構造変化が起き、ドナートアクセプターの距離が縮まりFRETが生じる。ジアシルグリセロール<ref><pubmed>16990811</pubmed></ref>、イノシトールリン脂質群<ref><pubmed>14528311</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref><ref><pubmed>18685081</pubmed></ref>を測定するために用いられている。

|+ 表1．

|rowspan="21" | 生体内小分子|| [[カルシウム]] ||Cameleon|| 1997 || 3-2 || <ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>

|[[wj:塩素|Cl^-]] ||Clomeleon|| 2000 || other || <ref><pubmed>11055428</pubmed></ref>

|[[wj:水素イオン濃度|水素イオン濃度]] (pH) ||GFpH, YFpH|| 2001 || other || <ref><pubmed>11716495</pubmed></ref>

|rowspan="25" | タンパク質リン酸化酵素 || [[カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質リン酸化酵素II]] ([[CaMKII]]) ||Camui α, green-Camui α, Camk2a reporter|| 2005, 2009, 2011, 2013 || 3-1 || <ref><pubmed>15788767</pubmed></ref><ref><pubmed> 19295602</pubmed></ref><ref name=ref23602566><pubmed> 23602566</pubmed></ref><ref name=ref21506563><pubmed> 21506563</pubmed></ref>

| [[Abl]] ||Picchu|| 2001 || 3-3 || <ref name=ref11752449 />

| [[Bcr]]-Abl ||Bcr-Abl activity sensor||2010 || 3-3 || <ref><pubmed>20817824</pubmed></ref>

|rowspan="8" | [[低分子量Gタンパク質]] || [[Ras]] ||Raichu-Ras, Fras|| 2001, 2006 || 3-2,2 || <ref><pubmed>16429133</pubmed></ref><ref name=ref11429608><pubmed> 11429608</pubmed></ref>

| [[Rap]] ||Raichu-Rap|| 2001 || 3-2 || <ref name=ref11429608></ref>

| [[Rac]] ||Raichu-[[Rac1]]|| 2004 || 3-2 || <ref name=ref14570905><pubmed>14570905</pubmed></ref>

| [[Rab5]] ||Raichu-Rab5|| 2008 || 3-2 || <ref><pubmed>18385674</pubmed></ref>

| [[Rho]] ||Raichu-RhoA|| 2003, 2011 || 3-2, 2 || <ref name=ref21423166><pubmed>21423166</pubmed></ref><ref><pubmed> 12860967</pubmed></ref>

| [[Cdc42]] ||Raichu-cdc42|| 2004, 2011 || 3-2, 2 || <ref name=ref14570905 /><ref name=ref21423166 />

|rowspan="6" | [[脂質]] || [[ホスファチジルイノシトール-3,4,5-三リン酸]] ([[PIP3|PIP₃]]) ||Fllip, FLIMPA|| 2003 || 3-4 || <ref><pubmed>14528311</pubmed></ref>

| [[ホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸]] ([[PIP2|PI(4,5)P₂]]) ||Pippi-PI(4,5)P₂|| 2008 || 3-4 || <ref name=ref18685081><pubmed>18685081</pubmed></ref>

| [[ホスファチジルイノシトール-3,4-二リン酸]] ([[PI(3,4)P2|PI(3,4)P₂]]) ||Pippi-PI(3,4)P₂|| 2008 || 3-4 || <ref name=ref18685081 />

| [[ホスファチジルイノシトール-4-リン酸]] ([[PI4P|PI4P]]) ||Pippi-PI(4)P|| 2008 || 3-4 || <ref name=ref18685081 />

| [[ホスファチジン酸]] ||Pii|| 2010 || 3-4 || <ref><pubmed>20826779</pubmed></ref>

| [[ジアシルグリセロール]] (DAG) ||Daglas, DIGDA|| 2006, 2008 || 3-4 || <ref name=ref18685081 /><ref><pubmed> 16990811</pubmed></ref>

|rowspan="6" | タンパク質相互作用 || [[アクチン]] || ||2004, 2008 || 2 || <ref><pubmed>15361876</pubmed></ref><ref><pubmed> 18512154</pubmed></ref>

| [[蛋白質チロシン脱リン酸化酵素1B]] ([[protein tyrosine phosphatase 1B]], [[PTP 1B]])-[[受容体型チロシンキナーゼ]] ([[receptor tyrosine kinase]]s, [[RTK]]s)相互作用 || || 2002 || 2 || <ref><pubmed>11872838</pubmed></ref>

| [[コフィリン]]-[[アクチン]]相互作用 || ||2008 || 2 || <ref><pubmed>17993279</pubmed></ref>

|rowspan="8" | [[プロテアーゼ]] || [[カスパーゼ-3]] ||EGFP-DEVD-EBFP|| 1998 || 1 || <ref><pubmed>9518501</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-8]] ||CFP-c3-YFP-c6-mRFP|| 2002 || 1 || <ref><pubmed>12409609</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-9]] ||SCAT9|| 2011 || 1 || <ref><pubmed>21637712</pubmed></ref>

| [[カスパーゼ-7]] ||VDEVDc|| 2006 || 1 || <ref><pubmed>17946841</pubmed></ref>

| [[マトリックスメタロプロテアーゼ]] ([[MMP]]) ||YFP-MSS-CFP^display, MTI-MMP-FRET biosensor|| 2007, 2008 || 1 || <ref><pubmed>17187878</pubmed></ref><ref><pubmed> 18441011</pubmed></ref>  

| [[wj:第Xa因子|第Xa因子]] || ||1996 || 1 || <ref><pubmed>8707050</pubmed></ref>

|[[カルパイン]]活性||pYSCS|| 2000 || 1 || <ref><pubmed>10688895</pubmed></ref>

| [[膜電位]] ||VSFP, Mermaid, ArcLight, VSFP-Butterfly|| 2001, 2008, 2012 || 3-1 || <ref><pubmed>11454036</pubmed></ref><ref><pubmed> 18622396</pubmed></ref><ref><pubmed> 22958819</pubmed></ref><ref><pubmed> 23868559</pubmed></ref>

The numbers in the Probe Design column correspond to the section number in the “Strategies of probe design” chapter of the main text. See the webpage by Dr. Michiyuki Matsuda http://www.lif.kyoto-u.ac.jp/labs/fret/e-phogemon/unifret.htm for updated information.

現在、多数の遺伝子工学的に作製されたタンパク質FRETプローブにおいて、GFPの色彩変異体、シアン色蛍光タンパク質CFPと黄色蛍光タンパク質YFPのFRETペアが広範に用いられている。近年、CloverとmRuby2が開発され、より良いFRETペアであると報告されている<ref><pubmed>22961245</pubmed></ref>。FRETのアクセプターとなるが蛍光を発しないREACh, darkVenus, superREAChなども用いられる。同じ理由により、

蛍光寿命は、[[GFP]]は2.5nsec、YFPでは2.9nsec、mCherryでは1.5nsec程度の値を取る。蛍光寿命プローブとしてはドナーとしてmGFP、アクセプターとしてmRFPもしくはmCherryが用いられる。

　1997年、宮脇、Tsienらによって、CFPおよびYFPを利用した、[[Calcium]] indicator, Cameleonが開発され<ref><pubmed>9278050</pubmed></ref>、さらに、cAMP<ref><pubmed>10620803</pubmed></ref>, cGMP<ref><pubmed>11140757</pubmed></ref>, リン酸化<ref><pubmed>11752449</pubmed></ref>を初めとした主要な細胞内シグナル伝達分子のFRETプローブが次々と作製され、分子のリアルタイムな活性および局在のの活性の解明に大きく貢献した。

　[[脳神経]]分野においては、林らが、2000年初期に記憶の形成に必須なシグナル分子、[[カルシウムカルモデュリンキナーゼII]] (CaMKII)の活性化を評価するためのFRETプローブ開発し分散培養系にてCaMkIIの可視化に成功した<ref><pubmed>15788767</pubmed></ref>。1990年代後半、Svobodaらによって、2光子顕微鏡が脳神経科学に導入され、神経回路ネットワークを保持したスライスおよび個体の生きた脳の神経活動を観察可能になった。林らは、神経細胞の連結部位、シナプスの[[シナプス後膜]]（[[スパイン]]）において、その形態を制御するactinの重合を可視化するためのFRETプローブを開発した<ref><pubmed>15361876</pubmed></ref>。一方、脳のスライスにおいては、波長依存的な蛍光の吸収が生じるため、ドナーとアクセプターの2波長を測定する蛍光強度比を測定するよりも、蛍光の散乱、吸収によって変化しない蛍光寿命測定法が導入された。安田、Svobodaらは、蛍光寿命測定を基に、スパインの構造的変化を誘導する低分子量Gタンパク質（[[Ras]]、[[cdc42]]、[[RhoA]]）などのシグナル伝達分子の活性化の変化を観察することに成功している<ref><pubmed>19295602</pubmed></ref><ref><pubmed>18556515</pubmed></ref><ref><pubmed>21423166</pubmed></ref>。  

　個体においてもFRET測定法が導入されている。神経回路ネットワークにおける[[シナプス]]の役割を解明する目的で、[[フェレット]]の[[大脳皮質]][[視覚野]]にCaMKIIプローブを発現し、[[片眼剥奪]]によって、神経回路ネットワークに変化を起こした時のCaMKIIの活性化の変化を観測している<ref><pubmed>22160721</pubmed></ref>。また、神経活動をモニターする目的で、Knöpfelらは、膜電位プローブを開発しマウスのヒゲ刺激の入力先である[[体性感覚野]][[barrel cortex]]での入力特異的な神経の活性化を観察している<ref><pubmed>20622860</pubmed></ref>。

　病態との関係では、神経細胞内のカルシウム濃度を測定するために、[[オレゴングリーン]]の蛍光寿命の変化から、カルシウム濃度を測定し、アストロサイトでのカルシウム濃度が、アルツハイマー様マウスと正常マウスで違うことが報告されている<ref><pubmed>19251629</pubmed></ref>。

　Homo-FRETも応用されている。CaMKIIは12量体を形成しているが、異方性の変化を基に、その構造中にdimerの単位が存在し、活性化に伴うdimer同士の位置関係が変化することをVogelらが明らかにしている<ref><pubmed>19339497</pubmed></ref>。  

　脳研究は、生きたままの状態の脳の神経細胞の活動を、広範囲で、より深部で観察したり、逆に神経細胞内の超微細構造を観察する方向に移るであろう。現在、FRETを基にしたin vivoイメージングは、応答の低さ、蛍光の弱さなどの難点はあるものの、蛍光タンパク質の蛍光強度や顕微鏡の性能の改良は日進月歩であり改善されていくであろう。また、神経活動に必要なシグナル伝達を同時に観察するために、マルチカラーイメージングの試みもなされるであろう。その際には、2つの波長を必要とする蛍光強度比変化を基にするFRET測定よりも、蛍光寿命を観察するFLIM測定が適している。