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[[image:シナプス小胞1.jpg|thumb|350px|'''図1．シナプス小胞のリサイクリング''']] | [[image:シナプス小胞1.jpg|thumb|350px|'''図1．シナプス小胞のリサイクリング''']] | ||
神経間の情報伝達は[[シナプス]] | 神経間の情報伝達は[[シナプス]]と呼ばれる微小な微小な神経接合部において行なわれる。シナプスは機能的にも形態的にも異なる[[シナプス前部]]とシナプス後部から構成され、[[シナプス前]]部から放出された[[神経伝達物質]]が、隣接したシナプス後部表面に存在する[[受容体]]に結合することによりシグナルが伝達される。 | ||
1960年代に[[ | 1960年代に[[wj:ベルンハルト・カッツ|Bernard Katz]]らは[[wj:カエル|カエル]]の神経−筋接合部を用いて電気生理学的な実験を行い、シナプス後部（この場合は[[wj:筋肉|筋肉]]）で観察される応答は、シナプス前部から放出される一定量のシグナル物質（彼らは「quanta（量子）」と名付けた）によって引き起されることを提唱した<ref name=ref1><pubmed>13175199</pubmed></ref>。 | ||
ちょうど同時期にPaladeらは[[電子顕微鏡]]で脳組織を観察し、シナプス前部と思われる構造体に数百もの小さな袋状の膜構造物を観察し、この小胞がquantaの正体であることを提唱した。「シナプス小胞」の発見である<ref name=ref2>'''Palade, G.E., Palay, S.L.,'''<br>Electron microscope observations of interneuronal and neuromuscular synapses. <br>''Anat. Rec.'', 1954. 118: p. 335-336.</ref>。 | ちょうど同時期にPaladeらは[[電子顕微鏡]]で脳組織を観察し、シナプス前部と思われる構造体に数百もの小さな袋状の膜構造物を観察し、この小胞がquantaの正体であることを提唱した。「シナプス小胞」の発見である<ref name=ref2>'''Palade, G.E., Palay, S.L.,'''<br>Electron microscope observations of interneuronal and neuromuscular synapses. <br>''Anat. Rec.'', 1954. 118: p. 335-336.</ref>。 | ||
1980年代になり、[[Heuser]]と[[Reese]]らは電気刺激直後（5ミリ秒）に固定した[[神経筋接合部]]を電子顕微鏡下で観察し、シナプス小胞と[[形質膜]]が融合している像を見いだし、神経伝達物質の放出は伝達物質を貯蔵したシナプス小胞の膜と形質膜の[[膜融合]]によって起こることを提唱した<ref name=ref3><pubmed>4348786</pubmed></ref>。また、痙攣を引き起こす[[ショウジョウバエ]]の[[温度感受性変異体]]である[[shibire]]ミュータントでは、シナプス前部からシナプス小胞が枯渇し、形質膜上にはオメガ（Ω）様の膜陥入像が見られた<ref name=ref4><pubmed>2573698</pubmed></ref>。温度を下げるとシナプス前部にシナプス小胞が再び現れることから、形質膜に融合したシナプス小胞はシナプス前部において再合成されることが示唆された。これらの歴史的な知見により、神経伝達物質の充填→[[エキソサイトーシス]]による膜融合→[[エンドサイトーシス]]による再形成形成というシナプス小胞の一連のサイクルが明らかになった（図1）。 | 1980年代になり、[[w:John_Heuser|Heuser]]と[[w:thomas_reese|Reese]]らは電気刺激直後（5ミリ秒）に固定した[[神経筋接合部]]を電子顕微鏡下で観察し、シナプス小胞と[[形質膜]]が融合している像を見いだし、神経伝達物質の放出は伝達物質を貯蔵したシナプス小胞の膜と形質膜の[[膜融合]]によって起こることを提唱した<ref name=ref3><pubmed>4348786</pubmed></ref>。また、痙攣を引き起こす[[ショウジョウバエ]]の[[温度感受性変異体]]である[[shibire]]ミュータントでは、シナプス前部からシナプス小胞が枯渇し、形質膜上にはオメガ（Ω）様の膜陥入像が見られた<ref name=ref4><pubmed>2573698</pubmed></ref>。温度を下げるとシナプス前部にシナプス小胞が再び現れることから、形質膜に融合したシナプス小胞はシナプス前部において再合成されることが示唆された。これらの歴史的な知見により、神経伝達物質の充填→[[エキソサイトーシス]]による膜融合→[[エンドサイトーシス]]による再形成形成というシナプス小胞の一連のサイクルが明らかになった（図1）。 | ||
== 物理化学的性質 == | == 物理化学的性質 == | ||
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[[SNAP-25]])もドッキング過程に重要であることが示唆されている<ref name=ref19><pubmed>24005294</pubmed></ref>。ニューロンにおけるシナプス小胞ドッキングを司る分子機構は不明な点が多い。 | [[SNAP-25]])もドッキング過程に重要であることが示唆されている<ref name=ref19><pubmed>24005294</pubmed></ref>。ニューロンにおけるシナプス小胞ドッキングを司る分子機構は不明な点が多い。 | ||
'''（2）プライミング'''：電子顕微鏡像では形態的にドッキングしているにも関わらず、電気生理学的に神経伝達物質が放出されない遺伝子欠損マウスが幾つか報告されており、その結果からドッキングと膜融合の間に、小胞が膜融合する能力を獲得するステップ、すなわちプライミングの存在が提唱された。[[CAPS]] (Calcium-dependent Activator Protein for Secretion)や [[Munc13]]などがプライミング因子の候補として挙げられている<ref name=ref20><pubmed>24363652</pubmed></ref>。これらのプライミング因子はSNAREタンパク質等の膜融合装置や形質膜でのセカンドメッセンジャー([[PIP2]]や[[ジアシルグリセロール]])を介して働いていると考えられる。 | '''（2）プライミング'''：電子顕微鏡像では形態的にドッキングしているにも関わらず、電気生理学的に神経伝達物質が放出されない遺伝子欠損マウスが幾つか報告されており、その結果からドッキングと膜融合の間に、小胞が膜融合する能力を獲得するステップ、すなわちプライミングの存在が提唱された。[[CAPS]] ([[Calcium]]-dependent Activator Protein for Secretion)や [[Munc13]]などがプライミング因子の候補として挙げられている<ref name=ref20><pubmed>24363652</pubmed></ref>。これらのプライミング因子はSNAREタンパク質等の膜融合装置や形質膜でのセカンドメッセンジャー([[PIP2]]や[[ジアシルグリセロール]])を介して働いていると考えられる。 | ||
'''（3）膜融合'''：シナプス小胞の形質膜への融合過程においては、3つのSNAREタンパク質が重要な役割を果たしている。[[wikipedia:James Rothman|James Rothman]]らは、[[ゴルジ]]装置における物質輸送に必要な可溶性タンパク質として[[NSF]]と[[SNAP]]という二種類のタンパク質を同定した。更にRothmanは、これら可溶性タンパク質の膜受容体(SNAP receptor ＝ SNARE)を探索するにあたり、NSFとSNAP複合体に結合するタンパク質を脳由来の膜画分を用いて行なった結果、既にシナプスで同定されていたシナプトブレビンとシンタキシン、SNAP-25が同定された<ref name=ref21><pubmed>8455717</pubmed></ref>。シナプトブレビンがシナプス小胞膜、シンタキシンとSNAP-25が形質膜にあることから、Rothmanはそれぞれ[[v-SNARE]](vesicular SNARE)とt-SNARE(target-SNARE)と名付け、シナプス小胞の形質膜の融合にはv-SNAREとt-SNAREがNSFやSNAPと巨大なタンパク質複合体を形成する必要があると提唱した。この「SNARE仮説」とその後の実証研究の功績によりRothmanは2013年ノーベル医学生理学賞を受賞した。現在では、NSFやSNAPは膜融合ではなく、膜融合後のSNAREタンパク質複合体を乖離させる働きをしていることが分かったが<ref name=ref22><pubmed>10769209</pubmed></ref> <ref name=ref23><pubmed>9177194</pubmed></ref>、SNAREタンパク質が膜融合を促進させるタンパク質であることは、リポソーム再構成実験によって示された<ref name=ref24><pubmed>9529252</pubmed></ref>。 | '''（3）膜融合'''：シナプス小胞の形質膜への融合過程においては、3つのSNAREタンパク質が重要な役割を果たしている。[[wikipedia:James Rothman|James Rothman]]らは、[[ゴルジ]]装置における物質輸送に必要な可溶性タンパク質として[[NSF]]と[[SNAP]]という二種類のタンパク質を同定した。更にRothmanは、これら可溶性タンパク質の膜受容体(SNAP receptor ＝ SNARE)を探索するにあたり、NSFとSNAP複合体に結合するタンパク質を脳由来の膜画分を用いて行なった結果、既にシナプスで同定されていたシナプトブレビンとシンタキシン、SNAP-25が同定された<ref name=ref21><pubmed>8455717</pubmed></ref>。シナプトブレビンがシナプス小胞膜、シンタキシンとSNAP-25が形質膜にあることから、Rothmanはそれぞれ[[v-SNARE]](vesicular SNARE)とt-SNARE(target-SNARE)と名付け、シナプス小胞の形質膜の融合にはv-SNAREとt-SNAREがNSFやSNAPと巨大なタンパク質複合体を形成する必要があると提唱した。この「SNARE仮説」とその後の実証研究の功績によりRothmanは2013年ノーベル医学生理学賞を受賞した。現在では、NSFやSNAPは膜融合ではなく、膜融合後のSNAREタンパク質複合体を乖離させる働きをしていることが分かったが<ref name=ref22><pubmed>10769209</pubmed></ref> <ref name=ref23><pubmed>9177194</pubmed></ref>、SNAREタンパク質が膜融合を促進させるタンパク質であることは、リポソーム再構成実験によって示された<ref name=ref24><pubmed>9529252</pubmed></ref>。 | ||
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===ヘルドのカリックスシナプスを用いた電気生理学的解析=== | ===ヘルドのカリックスシナプスを用いた電気生理学的解析=== | ||
哺乳類の脳幹部位に存在する[[聴覚]]系の中継シナプスである。その類い稀な大きさ故、脳幹[[スライス]] | 哺乳類の脳幹部位に存在する[[聴覚]]系の中継シナプスである。その類い稀な大きさ故、脳幹[[スライス]]標本においてシナプス前部とシナプス後部から同時に[[パッチクランプ記録]]が可能である。また、シナプス前部側の[[ガラス電極]]にシグナル分子を修飾する薬物や内在性タンパク質相互作用を修飾する[[wj:抗体|抗体]]や[[wj:ペプチド|ペプチド]]を導入し、そのシナプス伝達に対する効果をシナプス後部側の応答で検証できる。更に、[[膜容量]]測定法を適用することで、エキソサイトーシスやエンドサイトーシスに伴う膜容量の変化を測定することも可能であり、シナプス前部の分子メカニズムを調べるための中枢神経系のモデル標本として用いられている<ref name=ref40><pubmed>16896951</pubmed></ref>。 | ||
欠点としては、急性スライス標本であるため遺伝子の導入が困難であることや、胎生致死の遺伝子欠損マウスの解析が不可能であることが挙げられるが、近年、[[ウイルスベクター]]を利用してヘルドのカリックスシナプスに選択的に遺伝子導入する方法も開発されている<ref name=ref41><pubmed>19709630</pubmed></ref>。 | 欠点としては、急性スライス標本であるため遺伝子の導入が困難であることや、胎生致死の遺伝子欠損マウスの解析が不可能であることが挙げられるが、近年、[[ウイルスベクター]]を利用してヘルドのカリックスシナプスに選択的に遺伝子導入する方法も開発されている<ref name=ref41><pubmed>19709630</pubmed></ref>。 | ||
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===pH感受性GFP（pHluorin）を用いた解析=== | ===pH感受性GFP（pHluorin）を用いた解析=== | ||
[[緑色蛍光蛋白質]](GFP)の蛍光強度は溶液のpHにより変化する。GFPの遺伝子に変異を加え蛍光強度のpH依存的変化を増幅させた変異体が[[pHluorin]]である<ref name=ref44><pubmed>9671304</pubmed></ref>。pHluorinは7.1程度のpKa値を示し、中性域では強い[[wj:蛍光|蛍光]]を発するが、弱酸性域では蛍光が減弱する。この蛍光変化は可逆的である。シナプス小胞内腔はV-ATPaseの働きにより弱酸性に保たれているため、pHluorinをシナプス小胞タンパク質の内腔側に融合させて遺伝子導入させると、小胞内腔に存在する時は蛍光を発せず、エキソサイトーシスに伴って細胞外の中性溶液に暴露された時に強い蛍光を発する。その後形質膜に移行したpHluorinを持つシナプス小胞タンパク質がエンドサイトーシスによって新たな小胞に回収されると、小胞内腔が酸性化され、再び蛍光が消失する。最初に用いられたSynaptobrevinに融合させたSynaptopHluorinは細胞表面への局在が多くシグナル−ノイズ比が低いことが問題となっていたが、その後SynaptophysinやVGLUT1の内腔側に融合させた改良版が作られ<ref name=ref45><pubmed>16982422</pubmed></ref> <ref name=ref46><pubmed>16815333</pubmed></ref>、1小胞イメージングなども可能となり、エンドサイトーシスや小胞酸性化の動態や速度論的解析が現在活発に進められている<ref name=ref47><pubmed>18077369</pubmed></ref>。ただし、厳密に言えばpHluorinを融合させたタンパク質の動態を観察しているのであり、小胞「膜」のエンドサイトーシスを直接観察している訳ではないことに留意する必要がある。 | [[緑色蛍光蛋白質]]([[GFP]])の蛍光強度は溶液のpHにより変化する。GFPの遺伝子に変異を加え蛍光強度のpH依存的変化を増幅させた変異体が[[pHluorin]]である<ref name=ref44><pubmed>9671304</pubmed></ref>。pHluorinは7.1程度のpKa値を示し、中性域では強い[[wj:蛍光|蛍光]]を発するが、弱酸性域では蛍光が減弱する。この蛍光変化は可逆的である。シナプス小胞内腔はV-ATPaseの働きにより弱酸性に保たれているため、pHluorinをシナプス小胞タンパク質の内腔側に融合させて遺伝子導入させると、小胞内腔に存在する時は蛍光を発せず、エキソサイトーシスに伴って細胞外の中性溶液に暴露された時に強い蛍光を発する。その後形質膜に移行したpHluorinを持つシナプス小胞タンパク質がエンドサイトーシスによって新たな小胞に回収されると、小胞内腔が酸性化され、再び蛍光が消失する。最初に用いられたSynaptobrevinに融合させたSynaptopHluorinは細胞表面への局在が多くシグナル−ノイズ比が低いことが問題となっていたが、その後SynaptophysinやVGLUT1の内腔側に融合させた改良版が作られ<ref name=ref45><pubmed>16982422</pubmed></ref> <ref name=ref46><pubmed>16815333</pubmed></ref>、1小胞イメージングなども可能となり、エンドサイトーシスや小胞酸性化の動態や速度論的解析が現在活発に進められている<ref name=ref47><pubmed>18077369</pubmed></ref>。ただし、厳密に言えばpHluorinを融合させたタンパク質の動態を観察しているのであり、小胞「膜」のエンドサイトーシスを直接観察している訳ではないことに留意する必要がある。 | ||
== 有芯顆粒 == | == 有芯顆粒 == | ||
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中枢神経系シナプスの一部にはシナプス小胞よりも大きく(直径100~300ナノメートル)、電子顕微鏡で内腔が黒く見える[[大型有芯顆粒]]（Large Dense Core Vesicle: LDCV）が含まれるものがある（図5）。 | 中枢神経系シナプスの一部にはシナプス小胞よりも大きく(直径100~300ナノメートル)、電子顕微鏡で内腔が黒く見える[[大型有芯顆粒]]（Large Dense Core Vesicle: LDCV）が含まれるものがある（図5）。 | ||
シナプス小胞はシナプス前部の形質膜形質膜近傍からクラスター状に多数存在するのに対して、LDCVはシナプス部位から離れた部位に散在している。シナプス小胞には速い神経伝達を担うグルタミン酸、GABA、[[グリシン]] | シナプス小胞はシナプス前部の形質膜形質膜近傍からクラスター状に多数存在するのに対して、LDCVはシナプス部位から離れた部位に散在している。シナプス小胞には速い神経伝達を担うグルタミン酸、GABA、[[グリシン]]、アセチル[[コリン]]が含まれているのに対して、LDCVには[[ドーパミン]]などの[[モノアミン]]類や[[神経ペプチド]]、多種多様な[[神経栄養因子]]を神経伝達物質として含まれている。また、[[交感神経]]のシナプスにおいては、[[ノルエピネフリン]]や[[セロトニン]]を含む60〜80 nmの[[有芯小胞]]が見られ、これをLDCVと区別して[[small dense core vesicle]]（SDCV）と呼ぶ場合もある。シナプス小胞とLDCVは中に含まれる神経伝達物質の違いに加え、様々な性質が異なる。シナプス小胞から放出される神経伝達物質神経伝達物質は、主にシナプス後部側の[[イオンチャネル]]型受容体に作用するため、シナプス後部側に電気的なシナプス応答を引き起こす。一方、LDCVに含まれる伝達物質はシナプス後部側の[[Gタンパク共役型受容体]]や[[神経栄養因子受容体]]に作用し、[[セカンドメッセンジャー]]を介したシナプス伝達の修飾を行う。 | ||
中枢神経系でのLDCVからの伝達物質放出機構は明らかではないが、クロム親和性細胞を用いた研究から、シナプス小胞同様、SNARE複合体による膜融合で伝達物質放出を行っていると考えられている。しかし、シナプス小胞とLDCVでは[[カルシウム]]に対する応答性に違いがあることが知られている。伝達物質放出のためにシナプス小胞がシナプス前部局所での高濃度のCa<sup>2+</sup>濃度上昇を必要とするのに対し、LDCVは持続的な低濃度のCa<sup>2+</sup>濃度上昇を必要とする<ref name=ref48><pubmed>15572159</pubmed></ref>。SNARE複合体に含まれるSynaptobrevinやCa<sup>2+</sup>センサーであるSynaptotagminなどにはアイソフォームがあり、シナプス小胞とLDCVに存在するこれらのアイソフォームが異なる可能性が示唆されている<ref name=ref49><pubmed>21551071</pubmed></ref> <ref name=ref50 />。 | 中枢神経系でのLDCVからの伝達物質放出機構は明らかではないが、クロム親和性細胞を用いた研究から、シナプス小胞同様、SNARE複合体による膜融合で伝達物質放出を行っていると考えられている。しかし、シナプス小胞とLDCVでは[[カルシウム]]に対する応答性に違いがあることが知られている。伝達物質放出のためにシナプス小胞がシナプス前部局所での高濃度のCa<sup>2+</sup>濃度上昇を必要とするのに対し、LDCVは持続的な低濃度のCa<sup>2+</sup>濃度上昇を必要とする<ref name=ref48><pubmed>15572159</pubmed></ref>。SNARE複合体に含まれるSynaptobrevinやCa<sup>2+</sup>センサーであるSynaptotagminなどにはアイソフォームがあり、シナプス小胞とLDCVに存在するこれらのアイソフォームが異なる可能性が示唆されている<ref name=ref49><pubmed>21551071</pubmed></ref> <ref name=ref50 />。 | ||