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(ページの作成:「　Engrailed（En）遺伝子は、動物界で広く見られるホメオドメインタンパク質Enをコードする。Enは、転写因子としての機能を持つほか、古典的なシグナルペプチドを持たないにも拘わらずその一部は細胞外に分泌され、更に細胞外から他の細胞へ移行できるという細胞間シグナル分子としての性質も有する。加えて、eIF4Eに結合し翻訳を促進するという…」)
 
 
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　Engrailed（En）遺伝子は、動物界で広く見られるホメオドメインタンパク質Enをコードする。Enは、転写因子としての機能を持つほか、古典的なシグナルペプチドを持たないにも拘わらずその一部は細胞外に分泌され、更に細胞外から他の細胞へ移行できるという細胞間シグナル分子としての性質も有する。加えて、eIF4Eに結合し翻訳を促進するという翻訳調節因子としての側面も持つ。。EN2はとの関連が示されている一方、En1ヘテロ接合性マウスはパーキンソン病を示す。
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<font size="+1">[https://researchmap.jp/yyz 荒木 功人]</font><br>
''岩手大学 農学部''<br>
DOI:<selfdoi />　原稿受付日:2025年6月23日　原稿完成日:2025年9月26日<br>
担当編集委員:[https://researchmap.jp/yamagatm 山形 方人]（ハーバード大学・脳科学センター）<br>
</div>


・研究の歴史
英略称：En
　1920年代後半の研究により、ショウジョウバエの最初のengrailed（en）変異体が樹立された
<ref name=Eker1929>Eker (1929) The recessive mutant engrailed in Drosophila melanogaster. Hereditas 12, 217-222. https://doi.org/10.1111/j.1601-5223.1929.tb02503.x</ref>(Eker, 1929)。
こは、中胸小楯板、性櫛、翅異常をす生存可能なホモ接合体であった
<ref name=Brasted1941><pubmed>17247008</pubmed></ref>(Brasted, 1941);
<ref name=Tokunaga1961><pubmed>13777229</pubmed></ref>(Tokunaga, 1961)。
その後の研究により、enは翅原基の後部コンパートメント形成や
<ref name=GarciaBellido1972><pubmed>4627463</pubmed></ref>(Garcia-Bellido & Santamaria, 1972);
<ref name=Morata1975><pubmed>1134551</pubmed></ref>(Morata & Lawrence, 1975)、
セグメントポラリティー遺伝子の一つとして胚の体節化
<ref name=NussleinVolhard1980><pubmed>6776413</pubmed></ref>(Nüsslein-Volhard & Wieschaus, 1980)
に関与することなどが明らかになった。
1985年にはショウジョウバエのcDNA配列がホメオボックス遺伝子であることが判明した
<ref name=Fjose1985><pubmed>2481829</pubmed></ref>(Fjose et al., 1985);
<ref name=Poole1985><pubmed>3917855</pubmed></ref>(Poole et al., 1985)。
更に、脊椎動物を含む他の動物分類群においてen相同遺伝子の単離と解析が進んだ
<ref name=Joyner1985><pubmed>2416459</pubmed></ref>(Joyner et al., 1985);
<ref name=Dolecki1988><pubmed>2899533</pubmed></ref>(Dolecki & Humphreys, 1988);
<ref name=Kamb1989><pubmed>2734290</pubmed></ref>(Kamb et al., 1989);
<ref name=Holland1990><pubmed>1980115</pubmed></ref>(Holland & Williams, 1990);
<ref name=Wedeen1991><pubmed>1672111</pubmed></ref>(Wedeen et al., 1991);
<ref name=Holland1991><pubmed>1682161</pubmed></ref>(Holland et al., 1991);
<ref name=Webster1992><pubmed>1356008</pubmed></ref>(Webster & Mansour, 1992);
<ref name=Wray1995><pubmed>7774719</pubmed></ref>(Wray et al., 1995);
<ref name=Holland1997><pubmed>9165120</pubmed></ref>(Holland et al., 1997);
<ref name=deRosa1999><pubmed>10391241</pubmed></ref>(de Rosa et al., 1999);
<ref name=Imai2002><pubmed>14516697</pubmed></ref>(Imai et al., 2002);
<ref name=Jiang2002><pubmed>12436970</pubmed></ref>(Jiang & Smith, 2002);
<ref name=Eriksson2013><pubmed>23625086</pubmed></ref>(Eriksson et al., 2013)。


・サブファミリー
{{box|text=　''Engrailed''（''En''）遺伝子は、動物界で広く見られるホメオドメインタンパク質Enをコードする。Enは、転写因子としての機能を持つほか、古典的なシグナルペプチドを持たないにも拘わらずその一部は細胞外に分泌され、更に細胞外から他の細胞内へ移行できるという細胞間シグナル分子としての性質も有する。加えて、eIF4Eに結合し翻訳を促進するという翻訳調節因子としての側面も持つ。脊椎動物は、''Engrailed-1''（''En1''）および''Engrailed-2''（''En2''）の2つのパラログを有しており、これらは中脳—後脳境界の形成、小脳および中脳の発生、神経回路の構築、神経細胞の分化や生存維持において重要な役割を果たす。''EN2''は自閉スペクトラム症との関連が示されている一方、''En1''ヘテロ接合性マウスはパーキンソン病に特徴的なドーパミンニューロン減少と運動制御異常を示す。}}
　多くの無脊椎動物は単一のenを有する一方、ショウジョウバエには、enと隣接してそのパラログ遺伝子であるinvected（inv）が存在する<ref name=Poole1985><pubmed>3917855</pubmed></ref><ref name=Coleman1987><pubmed>2892756</pubmed></ref>。invを欠く個体は生存可能であり、表現が、enとinvの二重変異はenの表現型増強る、機能的に冗長であると考えられる<ref name=Gustavson1996><pubmed>8849895</pubmed></ref>。
　多くの脊椎動物は2つのen相同遺伝子En1およびEn2を有する（1）。ゼブラフィッシュなどの真骨魚類ではEn1およびEn2が2ずつ存在する。無顎類のゲノムにもenがるが、分子系統解析によれらは顎口類のEn1En2とは独立して重複したようである<ref name=Matsuura2008><pubmed>18488997</pubmed></ref>。
　En1遺伝子座にEn2をノックインしたマウスの解析によると、En1とEn2は機能的に冗長である<ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>。一方、En1遺伝子座にショウジョウバエのenをノックインしたマウスでは、四肢および中脳ドーパミン作動性（mDA）ニューロンの表現型のみが見られる<ref name=Hanks1998><pubmed>9778510</pubmed></ref><ref name=Ellisor2012><pubmed>23041116</pubmed></ref>。このノックインマウス内在性En2を除去すると中脳と小脳の発生に異常が生ずる<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>。これは、En2のみを欠くマウスが小脳に小さな欠損を呈するものの生存可能かつ生殖可能であるのと対照的である<ref name=Joyner1991><pubmed>1672471</pubmed></ref>。


・遺伝子の構造
== 研究の歴史 ==
代表的な脊椎動物種のEn1およびEn2の多くは、2つのエキソンと1つのイントロンから成る<ref name=Logan1992><pubmed>1363401</pubmed></ref>。
　1920年代後半の研究により、[[ショウジョウバエ]]の最初の''engrailed''（''en''）変異体が樹立された<ref name=Eker1929>'''Eker, R. (1929).<br>'''The recessive mutant engrailed in Drosophila melanogaster. ''Hereditas'' 12, 217-222. [https://bsd.neuroinf.jp/w/images/d/df/Hereditas_March_1929_EKER_THE_RECESSIVE_MUTANT_ENGRAILED_IN_DROSOPHILA_MELANOGASTER.pdf [PDF<nowiki>]</nowiki>]</ref>。その後の研究により、''en''は[[翅原基]]の後部コンパートメント形成や<ref name=Morata1975><pubmed>1134551</pubmed></ref>、[[セグメントポラリティー遺伝子]]の一つとして[[胚]]の[[体節]]化<ref name=NussleinVolhard1980><pubmed>6776413</pubmed></ref>に関与することなどが明らかになった。1985年には、ショウジョウバエの''en''遺伝子の[[cDNA]]配列が決定され、それが[[ホメオボックス遺伝子]]であることが判明した<ref name=Fjose1985><pubmed>2481829</pubmed></ref><ref name=Poole1985><pubmed>3917855</pubmed></ref>。更に、[[脊椎動物]]を含む他の動物分類群において''en''相同遺伝子の単離と解析が進んだ<ref name=Joyner1985><pubmed>2416459</pubmed></ref><ref name=Holland1990><pubmed>1980115</pubmed></ref><ref name=Holland1997><pubmed>9165120</pubmed></ref><ref name=Imai2002><pubmed>14516697</pubmed></ref>。
　ヒトEN1の下流には、皮膚特異的に作用するECE18エンハンサーが存在し、非ヒト霊長類とは異なる複数の置換を有しており、これによりエクリン汗腺の形成が促進される<ref name=Aldea2021><pubmed>33850016</pubmed></ref>。ECE18の更に下流には、胚の中脳後脳領域や皮膚外胚葉で活性を有する約1.5kb長のエンハンサーECE20が存在する<ref name=Aldea2023><pubmed>36745673</pubmed></ref>。EN1のプロモーター領域にはDEAF1が結合し、ヒト皮膚細胞において転写を活性化する<ref name=Aldea2019><pubmed>31145909</pubmed></ref>。
　一方、マウスEn2は自己調節的な発現制御を行わない<ref name=Logan1993><pubmed>8100765</pubmed></ref>。また転写開始点から上流4kb〜6kbには、中脳後脳領域特異的、および下顎筋芽細胞特異的エンハンサーが隣接して存在する<ref name=Logan1993><pubmed>8100765</pubmed></ref>。前者に存在する2つのPax2/5/8結合部位は、5-7体節期の発現開始時のみ発現量の増加に寄与し、それらの結合部位を欠失させてもヌル変異のような小脳の欠損は生じない<ref name=Song2000><pubmed>10640701</pubmed></ref>。En2の中脳後脳領域での発現はPax2に強く依存するので、別のPax2/5/8結合部位があるはずである<ref name=Bouchard2005><pubmed>15872005</pubmed></ref>。ツメガエルのEn2プロモーター（−2.6〜−1.9kb付近）には3つのLEF/TCF結合コンセンサス配列が存在する<ref name=McGrew1999><pubmed>10495268</pubmed></ref>。ゼブラフィッシュ全胚のChIP解析によると、En2aプロモーターには、Gli結合コンセンサス配列は見られないものの、Gliおよびリン酸化Smadが結合する<ref name=Maurya2011><pubmed>21266411</pubmed></ref>。さらに、ヒトのEN1およびEN2プロモーターの上流1kb付近にはヌクレオソームリモデリング因子複合体結合部位が存在する<ref name=Barak2003><pubmed>14609955</pubmed></ref>。
　ショウジョウバエ胚のChIP解析によると、en近傍にPrd（Pax）やTcfが結合する<ref name=MacArthur2009><pubmed>19627575</pubmed></ref><ref name=Junion2012><pubmed>22304916</pubmed></ref>。ショウジョウバエのenの上流約2kbまでの間と第1イントロンに、Polycombグループ（PcG）のPc、PscおよびPhが、invの上流約2kbまでの間にPcおよびPhが結合する<ref name=Strutt1997><pubmed>9372908</pubmed></ref>。ショウジョウバエのPcG 遺伝子Ph-pおよびPh-dのプロモーター領域にはEnの結合部位が存在し、ネガティブフィードバックループを構成する<ref name=Serrano1995><pubmed>7600986</pubmed></ref>。
　En1 mRNAの3'UTRには細胞質ポリアデニル化配列（CPE）が存在することから、その樹状突起への局在はCPE結合タンパク質により調節される可能性がある<ref name=DiNardo2007><pubmed>17399993</pubmed></ref>。in vitroにおけるEn1 mRNAの翻訳は、ポリアデニル化に依存して脱分極により増加し、この翻訳はラパマイシンにより阻害される。またEn2はmiR-212の標的である（Zhou et al., 2017）。


・タンパク質の構造 (図2)
== サブファミリー ==
　Logan et al. (1992) は、ショウジョウバエのEngrailed（En）、マウス、ヒト、ニワトリのEn1, En2およびアフリカツメガエルのEn2のアミノ酸配列を比較することにより、Enタンパク質において進化的に保存されている5つの領域を同定し、それぞれをEH1〜EH5と名付けた<ref name=Logan1992><pubmed>1363401</pubmed></ref>。CATアッセイによると、このうちEH1とEH5はEngrailedの転写抑制活性に関わる<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref>。
=== 無脊椎動物 ===
　EH1は、Enを初めとするホメオドメインタンパク質やフォークヘッドタンパク質、Tボックスタンパク質、Znフィンガータンパク質などにおいても見られるアミノ酸モチーフであり<ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref><ref name=Shimeld1997><pubmed>9237613</pubmed></ref><ref name=Copley2005><pubmed>16309560</pubmed></ref>、転写抑制補助因子であるGroucho（Gro）/Tleが結合する<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref><ref name=Dasen2001><pubmed>11731482</pubmed></ref>。in vivoで、EH1のみに変異を入れるだけでEnの転写抑制活性が失われる<ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref><ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>。ショウジョウバエのEnには、EH1とEH2の間（アミノ酸201〜205）に昆虫特有のGro結合部位（ehIFRPFモチーフ）が、EH1とは別に存在する<ref name=Hittinger2008><pubmed>18803772</pubmed></ref>。
　多くは単一の''en''を有する一方、ショウジョウバエには、''en''と隣接してその[[パラログ]]遺伝子である''[[invected]]''（''[[inv]]''）が存在する<ref name=Gustavson1996><pubmed>8849895</pubmed></ref>。''inv''を欠く個体は生存可能であり、表現型にも顕著な異常は見られないが、''en''と''inv''の二重変異体では''en''単独変異の[[表現型]]が増強されることから、両者は機能的に冗長であると考えられる<ref name=Gustavson1996><pubmed>8849895</pubmed></ref>。
　EH2およびEH3にはTALEホメオドメインタンパク質に属する転写補助因子Extradenticle（Exd）/Pbxが結合する<ref name=Peltenburg1996><pubmed>8698039</pubmed></ref>。特にEH2内の2つのトリプトファンの何れかをリジンに置換するとPbxと結合できなくなる<ref name=Erickson2007><pubmed>16959235</pubmed></ref>。また、この置換によりEnは、細胞外に移行できなくなる<ref name=Rampon2015><pubmed>25926358</pubmed></ref>。他のホメオドメインタンパク質と同様、EnはExd/Pbxの他、Homothorax（Hth）/Meisとヘテロ三量体を形成する。結合部位の詳細は不明であるが、Hth/MeisはEnに直接結合するとされる<ref name=Kobayashi2003><pubmed>12506004</pubmed></ref>。EH2のC末端の2つのアミノ酸とEH3全体は核移行シグナル（NLS）であると推定されている<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref><ref name=Cardon2023><pubmed>37032404</pubmed></ref>。また、EH2中のシステイン残基は、酸化還元調節に応じたEn2の細胞間シグナル伝達の調節に関与する<ref name=Amblard2020a><pubmed>32994473</pubmed></ref>。
=== 脊椎動物 ===
　EH4はホメオドメインであり、DNAへの結合に関わる<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。ホメオドメインを構成する3本のαヘリックスのうち第3ヘリックスと、ホメオドメインのN末端のヘリックスを構成しない数アミノ酸がDNAに結合する<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。SAAB法によるとEngrailed単独で最も高い親和性を示すDNA配列はTAATTAである<ref name=Ades1994><pubmed>8049221</pubmed></ref>。また、Exdとのヘテロ二量体化により、EnのDNA結合特異性が変化する<ref name=vanDijk1994><pubmed>7915200</pubmed></ref>。ショウジョウバエ胚におけるChIP解析によるとEnのコンセンサス結合配列はYAATYANBである<ref name=Solano2003><pubmed>12588842</pubmed></ref>。Enの結合親和性は、認識部位に隣接する、認識配列に類似した繰り返し配列を伴うDNA領域により増強される<ref name=Castellanos2020><pubmed>31992709</pubmed></ref>。
　多くは2つの''en''相同遺伝子''En1''および''En2''を有する<ref name=Holland1990><pubmed>1980115</pubmed></ref>。[[ゼブラフィッシュ]]では、それぞれの遺伝子がさらに重複し、''En1''および''En2''が各2コピーずつ存在する<ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref>。
　EH3の大部分とホメオドメインのN末端の一部を含む領域は、細胞表面のグリコサミノグリカン（GAG）との相互作用を通じて、Enの細胞外から細胞内への移行を制御する<ref name=Cardon2023><pubmed>37032404</pubmed></ref>。ホメオドメインのC末端側には、核外への移行シグナル配列（NES）/細胞外への分泌シグナルと、細胞外から細胞内への移行シグナル（膜透過ペプチド配列penetratin）が存在する<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref><ref name=Maizel1999><pubmed>10375508</pubmed></ref><ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref>。細胞外から細胞内への移行はエンドサイトーシスと、エンドサイトーシスを介さない直接的移行の2つの様式により起こる<ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref><ref name=Jiao2009><pubmed>19833724</pubmed></ref>。Enの細胞内外への出入りには、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸（PIP2）とコレステロールが必要である<ref name=Amblard2020b><pubmed>32434869</pubmed></ref>。EnのEH2ドメインのN末端側には高セリン領域が存在する。CK2によるこの領域のリン酸化は、EnホメオドメインのDNAへの結合を増強する一方<ref name=Bourbon1995><pubmed>7744743</pubmed></ref>、Enの細胞外分泌を阻害する<ref name=Maizel2002><pubmed>12117805</pubmed></ref>。また、Enは他のいくつかのホメオドメインタンパク質（Bicoid, Emx2, HoxA9, Prhなど）と同様に、真核生物翻訳開始因子4E （eIF4E）と結合するが<ref name=Nedelec2004><pubmed>15247416</pubmed></ref>、それらのホメオドメインタンパク質とは異なり<ref name=Topisirovic2005>Topisirovic & Borden (2005) Homeodomain proteins and eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E): an unexpected relationship. Histol Histopathol 20, 1275-1284.</ref>、EH1ドメインがeIF4E結合部位を兼ねることが推定されている<ref name=Rhoads2009><pubmed>19237539</pubmed></ref>。これとは別に、マウスのEn1のホメオドメインN末端に位置するリジンに点突然変異K313Eを導入すると、eIF4Eに結合しなくなる<ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref>。Foxa2との相互作用には高セリン領域からホメオドメインにかけての領域が関与する<ref name=Foucher2003><pubmed>12642491</pubmed></ref>。


図2　Engrailedタンパク質の構造
　''En1''遺伝子座に''En2''を[[ノックイン]]した[[マウス]]の解析によると、''En1''と''En2''は機能的に冗長である<ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>。一方、''En1''遺伝子座にショウジョウバエの''en''をノックインしたマウスでは、四肢の表現型のみが見られる<ref name=Hanks1998><pubmed>9778510</pubmed></ref>。このノックインマウスからさらに内在性''En2''を除去すると[[中脳]]と[[小脳]]の発生に異常が生ずる<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>。これは、''En2''のみを欠くマウスが小脳に小さな欠損を呈するものの生存可能かつ生殖可能であるのと対照的である<ref name=Joyner1991><pubmed>1672471</pubmed></ref>。
ニワトリEn2をモデルとして示す。緑は高セリン領域を示す。薄紫のバーはホメオドメイン（HD）中のαヘリックスを示す<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。4D9はEnに関する研究でしばしば用いられるモノクローナル抗体であり、本図ではそのエピトープが含まれる領域を示す<ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref>。ショウジョウバエEnではCATアッセイによりEH1とEH2の間の一部の領域（アミノ酸228〜282）が転写抑制活性を有することが示されているが<ref name=Han1993><pubmed>8334991</pubmed></ref>、この領域は脊椎動物のEnとの相同性は見られない。(*) MeisはEnに直接結合するが、Enのどの部分に結合するかは不明である。図左上のスケールバーは100アミノ酸長を表す。これら以外については本文参照のこと。
・発現
＜細胞内分布＞


En を発現させたCOS細胞において、細胞内のEnのうち、細胞外へ出るのは5%未満であると見積もられており、その大部分は核に局在する<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref>（Joliot et al., 1998）。Enはいくつかのニューロンにおいて樹状突起など核外に局在することが報告されている<ref name=Nedelec2004><pubmed>15247416</pubmed></ref><ref name=DiNardo2007><pubmed>17399993</pubmed></ref>（Nédélec et al., 2004; Di Nardo et al., 2007）。ゼブラフィッシュ胚中脳視蓋において、H2O2レベルが増加するとEn2の核への移行が促進される<ref name=Amblard2020a><pubmed>32994473</pubmed></ref>（Amblard et al., 2020a）。
[[ファイル:Araki Engrailed Fig1.png|サムネイル|'''図1. Engrailedタンパク質の構造'''<br>ニワトリEn2をモデルとして示す。緑は高セリン領域を示す。薄紫のバーはホメオドメイン（HD）中のαヘリックスを示す<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。4D9はEnに関する研究でしばしば用いられるモノクローナル抗体であり、本図ではそのエピトープが含まれる領域を示す<ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref>。ショウジョウバエEnではCATアッセイによりEH1とEH2の間の一部の領域（アミノ酸228〜282）が転写抑制活性を有することが示されているが<ref name=Han1993><pubmed>8334991</pubmed></ref>、この領域は脊椎動物のEnとの相同性は見られない。(*) MeisはEnに直接結合するが、Enのどの部分に結合するかは不明である。]]
== 構造 ==
=== 遺伝子およびmRNA ===
　代表的な脊椎動物種の''En1''および''En2''の多くは、2つの[[エキソン]]と1つの[[イントロン]]から成る<ref name=Logan1992><pubmed>1363401</pubmed></ref>。


＜初期胚の神経系における主な発現＞
　''En1'' [[mRNA]]の[[3'UTR]]には[[細胞質ポリアデニル化配列]]（CPE）が存在することから、その[[樹状突起]]への局在はCPE結合タンパク質により調節される可能性がある<ref name=DiNardo2007><pubmed>17399993</pubmed></ref>。in vitroにおける''En1'' mRNAの翻訳は、[[ポリアデニル化]]に依存して[[脱分極]]により増加し、この翻訳は[[ラパマイシン]]により阻害される。また''En2''は[[miR-212]]の標的である<ref name=Zhou2017><pubmed>28713997</pubmed></ref>。
　脊椎動物の初期胚では、En1、En2のmRNAおよびそれらのタンパク質の発現が中脳から第１菱脳胞（ロンボメア1）にかけて見られる（表1、<ref name=Davidson1988><pubmed>2908202</pubmed></ref>（Davidson et al., 1988）; <ref name=Davis1988a><pubmed>2907320</pubmed></ref>（Davis & Joyner, 1988）; <ref name=Davis1988b><pubmed>2454212</pubmed></ref>（Davis et al., 1988）; <ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref>（Davis et al., 1991）; <ref name=Logan1993><pubmed>8100765</pubmed></ref>（Logan et al., 1993）; <ref name=Rowitch1995><pubmed>7577673</pubmed></ref>（Rowitch & McMahon, 1995）; <ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>（Hanks et al., 1995）; <ref name=Gardner1988><pubmed>2464080</pubmed></ref>（Gardner et al., 1988）; <ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref>（Patel et al., 1989）; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; <ref name=BallyCuif1992><pubmed>1360404</pubmed></ref>（Bally-Cuif et al., 1992）; <ref name=Logan1996a><pubmed>8805331</pubmed></ref>（Logan et al., 1996）; <ref name=HemmatiBrivanlou1989><pubmed>2574664</pubmed></ref>（Hemmati-Brivanlou & Harland, 1989）; <ref name=HemmatiBrivanlou1991><pubmed>1679005</pubmed></ref>（Hemmati-Brivanlou et al., 1991）; <ref name=Eizema1994>Eizema et al. (1994)</ref>; <ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref>（Hatta et al., 1991）; <ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>（Ekker et al., 1992）; <ref name=Fjose1992><pubmed>1362650</pubmed></ref>（Fjose et al., 1992）; <ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref>（Force et al., 1999）; Tanaka et al., 2002）。En1 mRNAおよびEn1タンパク質陽性領域は発現初期には中脳前端まで至り、のちに発現領域は中脳後脳境界（MHB）付近に限られるようになる（表1、<ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref>（Davis et al., 1991）; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; <ref name=Logan1996a><pubmed>8805331</pubmed></ref>（Logan et al., 1996）; <ref name=Shamim1999><pubmed>10572038</pubmed></ref>（Shamim et al., 1999）; <ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>（Sgaier et al., 2005））。発現の時期には種差があり、マウスやニワトリではEn1の発現が先行する一方、ゼブラフィッシュではEn2の発現が先行する（<ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref>（Reifers et al., 1998）; <ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref>（Lun & Brand, 1998）; <ref name=Rhinn2001><pubmed>11179870</pubmed></ref>（Rhinn & Brand, 2001））。発生が進むとEn2タンパク質は中脳視蓋で前方から後方に向かって発現レベルが上昇する勾配を呈するようになる（<ref name=Itasaki1991><pubmed>1811932</pubmed></ref>（Itasaki et al., 1991））。ゼブラフィッシュ胚において、H2O2レベルを上昇させると中脳視蓋におけるEn2タンパク質の発現勾配がより急になること、En2はH2O2が高レベルの細胞から分泌され、低レベルの細胞に取り込まれること、En2が細胞に取り込まれるとH2O2レベルが上昇することが報告されている（<ref name=Amblard2020a><pubmed>32994473</pubmed></ref>（Amblard et al., 2020a））。
　また、脊髄から後脳後部にかけての腹側介在ニューロンでもEn1 mRNAおよびEn1タンパク質が発現する（表1、<ref name=Davidson1988><pubmed>2908202</pubmed></ref>（Davidson et al., 1988）; <ref name=Davis1988a><pubmed>2907320</pubmed></ref>（Davis & Joyner, 1988）; <ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref>（Davis et al., 1991）; <ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>（Hanks et al., 1995）; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; <ref name=Eizema1994>Eizema et al. (1994)</ref>; <ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref>（Hatta et al., 1991）; <ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>（Ekker et al., 1992）; <ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref>（Force et al., 1999）; <ref name=Higashijima2004><pubmed>15215305</pubmed></ref>（Higashijima et al., 2004）; <ref name=Severi2018><pubmed>30206288</pubmed></ref>（Severi et al., 2018））。マウスでは、このEn1陽性介在ニューロンは、脊髄のPax2陽性介在ニューロンの一部であり、その発生はPax6に依存する（Burrill et al., 1997; Matise & Joyner, 1997）。


＜中脳後脳関連遺伝子間の初期胚における発現相互依存性＞
=== タンパク質 ===
　脊椎動物初期胚の中脳後脳領域においてEn1と相前後して発現を開始し、協調して中脳、後脳の発生に関わる遺伝子として、Wnt1、Pax2、Fgf8が存在する。初期胚の脳において、Wnt1、Pax2、Fgf8の異所的発現あるいは機能喪失は、En1の発現の変化を引き起こす（<ref name=McMahon1992><pubmed>1346260</pubmed></ref>（McMahon et al., 1992）; Danielian & McMahon, 1996; Koster et al., 1996; Lekven et al., 2003; Ye et al., 2001; <ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref>（Lun & Brand, 1998）; Ye et al., 1998; <ref name=Liu1999><pubmed>10398684</pubmed></ref>（Liu et al., 1999, 2003）; <ref name=Shamim1999><pubmed>10572038</pubmed></ref>（Shamim et al.; 1999）; <ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref>（Reifers et al., 1998）; またBuckles et al., 2004 も参照のこと）。同様にEn1の異所的発現あるいは機能喪失は、Wnt1、Pax2、Fgf8の発現の変化を引き起こす（<ref name=Shamim1999><pubmed>10572038</pubmed></ref>（Shamim et al., 1999）; <ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999）; Ristoratore et al., 1999; Liu & Joyner, 2001; Ye et al., 2001; Picker et al., 2002）。したがって、初期胚の中脳・後脳領域において、En1、Wnt1、Pax2、Fgf8は互いの発現維持に相互依存している。一方で、それぞれの発現開始には関与しないことが示されている（Liu & Joyner, 2001; <ref name=McMahon1992><pubmed>1346260</pubmed></ref>（McMahon et al., 1992）; Ye et al., 2001; Chi et al., 2003）。ニワトリでは脊索で発現するFgf4が中脳後脳領域におけるEn1の発現を誘導することが提唱されているが、マウスやゼブラフィッシュの脊索におけるFgf4の発現は報告されていない（<ref name=Shamim1999><pubmed>10572038</pubmed></ref>（Shamim et al.; 1999）; <ref name=Rhinn2001><pubmed>11179870</pubmed></ref>（Rhinn & Brand, 2001））。
　Loganら<ref name=Logan1992><pubmed>1363401</pubmed></ref>は、ショウジョウバエのEngrailed（En）、マウス、[[ヒト]]、[[ニワトリ]]のEn1, En2および[[アフリカツメガエル]]のEn2のアミノ酸配列を比較することにより、Enタンパク質において進化的に保存されている5つの領域を同定し、それぞれをEH1〜EH5と名付けた('''図1''')。CATアッセイによると、このうちEH1とEH5はEngrailedの[[転写抑制]]活性に関わる<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref>。
　Wnt1、Pax2、Fgf8はEn2 mRNAおよびEn2タンパク質の発現維持にも関与する（Sugiyama et al., 1998; Okafuji et al., 1999; Crossley et al., 1996; Shimamura & Rubenstein, 1997; <ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref>（Reifers et al., 1998）; <ref name=Liu1999><pubmed>10398684</pubmed></ref>（Liu et al., 1999）; <ref name=Shamim1999><pubmed>10572038</pubmed></ref>（Shamim et al.; 1999）; Sato et al., 2001）。また､Wnt1およびPax2ノックアウトマウスではEn2が発現しないことが、Pax2変異ゼブラフィッシュではEn1が発現しないことが報告されており、これはEn2（ゼブラフィッシュの場合はEn1）の発現開始がそれらの遺伝子に依存することを示唆する（<ref name=McMahon1992><pubmed>1346260</pubmed></ref>（McMahon et al., 1992）; Schwarz et al., 1999; <ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref>（Lun & Brand, 1998））。
　なお、EnによるWnt1、Pax2、Fgf8の誘導や、Fgf8によるEnの誘導は間接的であると考えられている（<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999）; Liu et al., 2003）。加えて、Pax5、Lmx1b、Ldb1、Tle4 (Grg4)、Nkx6、Voxといった遺伝子も初期胚の中脳後脳領域においてEn mRNAおよびEnタンパク質の発現を調節する（Funahashi et al., 1995; Guo et al., 2007; Kim et al., 2016; Sugiyama et al., 2000; Ma et al., 2013; Fabian et al. 2016）。


＜無脊椎動物のMHB様領域＞
　EH1は、Enを初めとするホメオドメインタンパク質や[[フォークヘッド]]タンパク質、[[Tボックス]]タンパク質、[[Znフィンガー]]タンパク質などにおいても見られるアミノ酸モチーフであり<ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref>、転写抑制補助因子である[[Groucho]]（[[Gro]]）/[[Tle]]が結合する<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref><ref name=Dasen2001><pubmed>11731482</pubmed></ref>。in vivoで、EH1のみに変異を入れるだけでEnの転写抑制活性が失われる<ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref><ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>。ショウジョウバエのEnには、EH1とEH2の間（アミノ酸201〜205）に[[昆虫]]特有のGro結合部位（[[ehIFRPFモチーフ]]）が、EH1とは別に存在する<ref name=Hittinger2008><pubmed>18803772</pubmed></ref>。
　尾索動物であるホヤの尾芽胚において、Enは脊椎動物のMHB類似領域付近の前後2箇所で発現する（<ref name=Imai2002><pubmed>14516697</pubmed></ref>（Imai et al., 2002）; <ref name=Jiang2002><pubmed>12436970</pubmed></ref>（Jiang & Smith, 2002））。そのうち後部発現領域で重複して発現するFgf8/17/18をノックダウンするとEngrailed陽性領域が一続きになる（Imai et al., 2009）。一方、頭索動物であるナメクジウオでは、受精後15時間の神経胚期に前後軸に関し中央付近の神経組織の2箇所で小さなEn陽性領域が出現し、それとは独立して受精の24時間後には、頭部にもEn陽性領域が出現する（<ref name=Holland1997><pubmed>9165120</pubmed></ref>（Holland et al., 1997））。但し、この頭部の陽性領域は脊椎動物のMHBに相当する領域では無いと考えられている。半索動物は脊索動物のような中枢神経系を持たず、散在したニューロンネットワークを有するが（Nomaksteinsky et al., 2009; Miyamoto et al., 2010）、前方の外胚葉においてEngrailedを含む脊椎動物初期胚の脳の各領域の遺伝子マーカーが、脊椎動物と類似した発現パターンを呈する（Lowe et al., 2003）。このEnの発現はFgf8/17/18に依存する（Pani et al., 2012）。ショウジョウバエ胚頭部にも脊椎動物のMHBと同様、Otx （otd）、Gbx （unpg）の発現境界面があり、付近でenやWnt （wg）が発現するが、Pax2/5/8 （D-pax2、poxn）やFgf8 （pyr、bnl、ths）はこの境界面で発現しない（Urbach, 2007）。


＜中期発生以降の神経系における発現＞
　EH2およびEH3には[[TALEホメオドメイン]]タンパク質に属する転写補助因子[[Extradenticle]]（[[Exd]]）/[[Pbx]]が結合する<ref name=Peltenburg1996><pubmed>8698039</pubmed></ref>。特にEH2内の2つの[[トリプトファン]]の何れかを[[リジン]]に置換するとPbxと結合できなくなる<ref name=Erickson2007><pubmed>16959235</pubmed></ref>。また、この置換によりEnは、細胞外に移行できなくなる<ref name=Rampon2015><pubmed>25926358</pubmed></ref>。他のホメオドメインタンパク質と同様、EnはExd/Pbxの他、[[Homothorax]] ([[Hth]])/[[Meis]]とヘテロ三量体を形成する。結合部位の詳細は不明であるが、Hth/MeisはEnに直接結合するとされる<ref name=Kobayashi2003><pubmed>12506004</pubmed></ref>。EH2のC末端の2つのアミノ酸とEH3全体は[[核移行シグナル]] ([[NLS]])であると推定されている<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref><ref name=Cardon2023><pubmed>37032404</pubmed></ref>。また、EH2中の[[システイン]]残基は、[[酸化]][[還元]]調節に応じたEn2の[[細胞間シグナル伝達]]の調節に関与する<ref name=Amblard2020><pubmed>32994473</pubmed></ref>。
　発生初期の脳の領域化以降も、主として中脳や小脳においてEnの発現が見られる。マウスにおいて、En1およびEn2がmDAニューロンにおいて、またEn1が上オリーブ核のグリシン作動性、コリン作動性およびGABA作動性ニューロンにおいて、胚発生期から成体まで発現する（<ref name=Simon2001><pubmed>11474113</pubmed></ref>（Simon et al., 2001）, <ref name=Simon2004><pubmed>15483627</pubmed></ref>（Simon et al., 2004）; Altieri et al., 2015）。また、縫線核ではEn1およびEn2が5-HTニューロンで胚発生期に発現し、En1の発現は出生後も継続する（Fox & Deneris, 2012）。胚発生15.5日目（E15.5）〜出生後0日目（P0）のマウス胚小脳では、苔状線維と登上線維の神経支配と合致したEn2の縞状の発現が見られる（Millen et al., 1995; Choi et al., 2011）。
　海馬ではE16以降、En1およびEn2が低レベルで発現し、シナプス形成が盛んに起こる出生時および生後1週間の間に、En2の発現は激減する（Soltani et al., 2017）。
　出生後のマウスの網膜、外側膝状体、一次視覚野でEn1が発現する（Magdaleno et al., 2006; Thompson et al., 2014; Chen et al., 2024）。
　一方、ニワトリでは、孵卵開始10日目の中脳視蓋において浅灰白線維層（SGFS）のg〜j層と脳室帯でEn2の発現が見られ、特にSGFS のi層で発現が高い（Omi et al., 2014）。また、この時期でも中脳視蓋後方から前方にかけての発現勾配が見られる。


＜神経系以外の主要な発現＞
　EH4は[[ホメオドメイン]]であり、DNAへの結合に関わる<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。ホメオドメインを構成する3本の[[αヘリックス]]のうち第3ヘリックスと、ホメオドメインのN末端のヘリックスを構成しない数アミノ酸がDNAに結合する<ref name=Kissinger1990><pubmed>1977522</pubmed></ref>。[[SAAB法]]によるとEngrailed単独で最も高い親和性を示すDNA配列はTAATTAである<ref name=Ades1994><pubmed>8049221</pubmed></ref>。また、Exdとのヘテロ二量体化により、EnのDNA結合特異性が変化する<ref name=vanDijk1994><pubmed>7915200</pubmed></ref>。ショウジョウバエ胚における[[ChIP解析]]によるとEnのコンセンサス結合配列はYAATYANBである<ref name=Solano2003><pubmed>12588842</pubmed></ref>。Enの結合親和性は、認識部位に隣接する、認識配列に類似した繰り返し配列を伴うDNA領域により増強される<ref name=Castellanos2020><pubmed>31992709</pubmed></ref>。
　神経系以外では、En1 mRNAおよびEn1タンパク質が肢芽の腹側外胚葉で（表1、<ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref>（Davis et al., 1991）; Loomis et al., 1996; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; Ros et al., 1996; <ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>（Ekker et al., 1992）; <ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref>（Force et al., 1999）; Tanaka et al., 2002）、En2 mRNAおよびEn2タンパク質が顎の筋肉で発現する（表1、<ref name=Logan1993><pubmed>8100765</pubmed></ref>（Logan et al., 1993）; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; <ref name=HemmatiBrivanlou1991><pubmed>1679005</pubmed></ref>（Hemmati-Brivanlou et al., 1991）; Hatta et al., 1990, <ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref>（Hatta et al., 1991）; <ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>（Ekker et al., 1992））。また、マウス、ニワトリ、アフリカツメガエルでは、En1が体節および派生する筋肉細胞で発現するが（表1、<ref name=Davidson1988><pubmed>2908202</pubmed></ref>（Davidson et al., 1988）; <ref name=Davis1988a><pubmed>2907320</pubmed></ref>（Davis & Joyner, 1988）; <ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref>（Davis et al., 1991）; <ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>（Hanks et al., 1995）; Spörle, 2001; <ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref>（Gardner & Barald, 1992）; <ref name=Cheng2004><pubmed>15073149</pubmed></ref>（Cheng et al., 2004）; Grimaldi et al., 2004）、ゼブラフィッシュではEn1aに加えてEn2aも発現する（表1、<ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref>（Patel et al., 1989）; <ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref>（Hatta et al., 1991）; <ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>（Ekker et al., 1992）; Fjose et al., 1992; Devoto et al., 1996; Wolff et al., 2003）。


＜無脊椎動物のMHB様領域以外の神経系における発現＞
　EH3の大部分とホメオドメインのN末端の一部を含む領域は、細胞表面の[[グリコサミノグリカン]]（[[GAG]]）との相互作用を通じて、Enの細胞外から細胞内への移行を制御する<ref name=Cardon2023><pubmed>37032404</pubmed></ref>。ホメオドメインのC末端側には、[[核外移行シグナル配列]]（[[NES]]）/細胞外への分泌シグナルと、細胞外から細胞内への移行シグナル（[[膜透過ペプチド]]配列[[penetratin]]）が存在する<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref><ref name=Maizel1999><pubmed>10375508</pubmed></ref><ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref>。細胞外から細胞内への移行は[[エンドサイトーシス]]と、エンドサイトーシスを介さない直接的移行の2つの様式により起こる<ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref><ref name=Jiao2009><pubmed>19833724</pubmed></ref>。Enの細胞内外への出入りには、[[ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸]]（[[PIP2]]）と[[コレステロール]]が必要である<ref name=Amblard2020b><pubmed>32434869</pubmed></ref>。EnのEH2ドメインのN末端側には高[[セリン]]領域が存在する。[[カゼインキナーゼ2]] ([[CK2]])によるこの領域の[[リン酸化]]は、EnホメオドメインのDNAへの結合を増強する一方<ref name=Bourbon1995><pubmed>7744743</pubmed></ref>、Enの細胞外分泌を阻害する<ref name=Maizel2002><pubmed>12117805</pubmed></ref>。また、Enは他のいくつかのホメオドメインタンパク質（[[Bicoid]], [[Emx2]], [[HoxA9]], [[Prh]]など）と同様に、[[真核生物翻訳開始因子4E]] ([[eIF4E]])と結合するが<ref name=Nedelec2004><pubmed>15247416</pubmed></ref>、それらのホメオドメインタンパク質とは異なり<ref name=Topisirovic2005><pubmed>16136508</pubmed></ref>、EH1ドメインがeIF4E結合部位を兼ねることが推定されている（<ref name=Rhoads2009><pubmed>19237539</pubmed></ref>、Alain Prochiantz、私信）。これとは別に、マウスのEn1のホメオドメインN末端に位置するリジンに点突然変異K313Eを導入すると、eIF4Eに結合しなくなる<ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref>。[[Foxa2]]との相互作用には高セリン領域からホメオドメインにかけての領域が関与する<ref name=Foucher2003><pubmed>12642491</pubmed></ref>。
　前述した無脊椎動物のMHB様領域における発現以外に、棘皮動物（<ref name=Lowe1997><pubmed>9165120</pubmed></ref>（Lowe & Wray, 1997）; Byrne et al., 2005; Yaguchi et al., 2006）、節足動物（<ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref>（Patel et al., 1989）; Duman-Scheel & Patel, 1999）、環形動物（<ref name=Wedeen1991><pubmed>1672111</pubmed></ref>（Wedeen & Weisblat, 1991）; Seaver & Kaneshige, 2006）の神経系においてen mRNAまたはenタンパク質の発現が報告されている。


・機能
== 発現 ==
＜分子としての機能＞
=== 細胞内分布 ===
　Enは、転写抑制因子としても転写活性化因子としても機能する（<ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref>（Smith & Jaynes, 1996）; <ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref>（Tolkunova et al., 1998）; Serrano & Maschat, 1998; <ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999）; Alexandre & Vincent, 2003）。また直接的に転写活性化因子として機能する他、別の転写抑制因子を抑制することにより間接的に転写活性化を引き起こす可能性があり（<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999））、ショウジョウバエでは、そのような別の転写抑制因子としてSloppy-paired（Slp）が同定されている（Alexandre & Vincent, 2003）。Enによる転写抑制には転写抑制補助因子Groが必要である（Hittinger & Carroll, 1997）。更に、Enの転写抑制活性は、Ext/PbxおよびHth/Meisとヘテロ三量体を形成することにより増強される（<ref name=Kobayashi2003><pubmed>12506004</pubmed></ref>（Kobayashi et al., 2003））。
　Enを発現させた[[COS細胞]]において、細胞内のEnのうち、細胞外へ出るのは5%未満であると見積もられており、その大部分は核に局在する<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref>。Enはいくつかのニューロンにおいて樹状突起など核外に局在することが報告されている<ref name=DiNardo2007><pubmed>17399993</pubmed></ref><ref name=Nedelec2004><pubmed>15247416</pubmed></ref>。ゼブラフィッシュ胚中脳視蓋において、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>レベルが増加するとEn2の核への移行が促進される<ref name=Amblard2020><pubmed>32994473</pubmed></ref>。
　また、Enは、非典型的分泌経路を介して細胞間シグナル分子としても機能する（<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref>（Joliot et al., 1998）; <ref name=Maizel1999><pubmed>10375508</pubmed></ref>（Maizel et al., 1999）; <ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref>（Dupont et al., 2007））。
　更に、EnはeIF4Eに結合し、タンパク質合成を刺激することが、E17のマウス胚背側上丘において示されている（<ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref>（Stettler et al., 2012））。この刺激によりミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを構成するNdufs3の翻訳が促進され、ATP合成が増加し、それに引き続くATPの分泌とアデノシンへの加水分解を経てアデノシンA1受容体が活性化される。
　加えてEN1が、ヒト293T細胞においてGSK3βやSIAHには依存しないプロテアソーム分解経路を介してβカテニンを不安定化することや（Bachar-Dahan et al., 2006）、EN2が食道扁平上皮癌細胞Kyse150おいて、PP2Aの調節サブユニットB55αに直接結合し、ホスファターゼ活性を抑制することが報告されている（Cao et al., 2023）。


＜転写の標的遺伝子＞
=== 初期胚の神経系における主な発現 ===
　転写因子としてのEnの標的遺伝子はショウジョウバエで詳細に研究されている。β3-チューブリン、ニューログリアン、slp、frizzled2、distal-lessは、Enの標的遺伝子として抑制されることが、polyhomeoticは活性化されることがin vivoで実証されている（<ref name=Serrano1997><pubmed>9065400</pubmed></ref>（Serrano et al., 1997）; Siegler & Jia, 1999; <ref name=Kobayashi2003><pubmed>12506004</pubmed></ref>（Kobayashi et al., 2003）; Fujioka et al., 2012; <ref name=Solano2003><pubmed>12588842</pubmed></ref>（Solano et al., 2003）; Gebelein et al., 2004; Serrano & Maschat, 1998）。<ref name=Solano2003><pubmed>12588842</pubmed></ref>（Solano et al., 2003）は、ChIP法により胚におけるEnの標的遺伝子の網羅的探索を行い、ネトリン受容体をコードするfrazzled (fra)を含む、神経発生に関わる36の遺伝子をEnの標的遺伝子の候補として同定した（<ref name=Solano2003><pubmed>12588842</pubmed></ref>（Solano et al., 2003））。後にfraはin vivoでEnの標的遺伝子であることが確認されている（<ref name=Joly2007><pubmed>17609121</pubmed></ref>（Joly et al., 2007））。Bonneaud et al. (2017) は、EnとショウジョウバエのPax3/7ホモログGooseberry-Neuro（GsbN）の両方により制御される標的遺伝子の網羅的探索をChIP on chipとトランスクリプトーム分析により行うことで、175の候補遺伝子を同定した。そのうち12の遺伝子が腹側神経索においてEnとGsbNと遺伝学的に相互作用することを示した（Bonneaud et al., 2017）。
　脊椎動物の初期胚では、''En1''、''En2''のmRNAおよびそれらのタンパク質の発現が[[中脳]]から[[第1菱脳胞]]（[[ロンボメア1]]）にかけて見られる<ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref><ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref><ref name=Patel1989><pubmed>2570637</pubmed></ref><ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref><ref name=Sgaier2005><pubmed>15629700</pubmed></ref><ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref><ref name=Logan1996><pubmed>8805331</pubmed></ref><ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref><ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>。''En1'' mRNAおよびEn1タンパク質陽性領域は発現初期には中脳前端まで至り、のちに発現領域は[[中脳後脳境界]]（[[midbrain–hindbrain boundary]], [[MHB]]）付近に限られるようになる<ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref><ref name=Sgaier2005><pubmed>15629700</pubmed></ref><ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref><ref name=Logan1996><pubmed>8805331</pubmed></ref><ref name=Shamim1999><pubmed>9927596</pubmed></ref>。発現の時期には種差があり、マウスやニワトリでは''En1''の発現が先行する一方、ゼブラフィッシュでは''En2''の発現が先行する<ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref><ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref><ref name=Rhinn2001><pubmed>11179870</pubmed></ref>。発生が進むとEn2タンパク質は[[中脳視蓋]]で前方から後方に向かって発現レベルが上昇する勾配を呈するようになる<ref name=Itasaki1991><pubmed>1811932</pubmed></ref>。ゼブラフィッシュ胚において、H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>レベルを上昇させると中脳視蓋におけるEn2タンパク質の発現勾配がより急になること、En2はH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>が高レベルの細胞から分泌され、低レベルの細胞に取り込まれること、En2が細胞に取り込まれるとH<sub>2</sub>O<sub>2</sub>レベルが上昇することが報告されている<ref name=Amblard2020><pubmed>32994473</pubmed></ref>。
　脊椎動物では、神経系におけるEnの標的遺伝子として、微小管結合タンパク質1b、および長鎖散在反復配列LINE-1がin vivoで同定されている（Mainguy et al., 2000; Montesinos et al., 2001; <ref name=Foucher2003><pubmed>12642491</pubmed></ref>（Foucher et al., 2003）; de Thé et al., 2018）。また、ニワトリ初期胚の脳において、Pax6が標的遺伝子の候補として同定されている（<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999））。更に、非小細胞肺癌細胞においてテネイシンCがEN2の標的遺伝子として同定されている（Li et al., 2023）。
　脊椎動物の初期胚の脳における、EnによるWnt1、Pax2、Fgf8の誘導は直接的なものではないことを先に述べたが、同様に、Enによる軸索ガイダンスや細胞のソーティングに関わる細胞表面タンパク質をコードするEphrinA2やEphrinA5の発現誘導も（Shigetani et al., 1996; <ref name=Logan1996a><pubmed>8805331</pubmed></ref>（Logan et al., 1996）; <ref name=Lee1997><pubmed>9052784</pubmed></ref>（Lee et al., 1997））、間接的な制御であると推定される（<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999））。


＜中脳および後脳の初期発生における機能＞
　また、脊髄から後脳後部にかけての腹側[[介在ニューロン]]でも''En1'' mRNAおよびEn1タンパク質が発現する<ref name=Force1999><pubmed>10101175</pubmed></ref><ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref><ref name=Davis1991><pubmed>1680044</pubmed></ref><ref name=Gardner1992><pubmed>1354990</pubmed></ref><ref name=Hatta1991><pubmed>1682127</pubmed></ref><ref name=Ekker1992><pubmed>1363539</pubmed></ref>。マウスでは、このEn1陽性介在ニューロンは、脊髄の[[Pax2]]陽性介在ニューロンの一部であり、その発生は''[[Pax6]]''に依存する<ref name=Burrill1997><pubmed>9409667</pubmed></ref><ref name=Matise1997><pubmed>9315901</pubmed></ref>。
　初期胚において、En1とEn2は、中脳後脳境界（MHB）オーガナイザーの維持や、中脳間脳境界（DMB）の確立と維持を通じて、発生中の脳の領域化に寄与する（<ref name=Wurst1994><pubmed>7954809</pubmed></ref>（Wurst et al., 1994）; <ref name=Joyner1989><pubmed>2560759</pubmed></ref>（Joyner et al., 1989）, <ref name=Joyner1991><pubmed>1672471</pubmed></ref>（Joyner et al., 1991）; Joyner, 1996; Simon et al., 2003; Bilovocky et al., 2003; <ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>（Araki & Nakamura, 1999）; Matsunaga et al., 2000; Scholpp et al., 2003）。脳の領域化においてEnは専ら転写因子として機能し、細胞間シグナル分子としての役割は小さい、とする報告がある一方（Lesaffre et al., 2007）、DMBの確立にはEnが分泌されることが必要であることも示されている（<ref name=Rampon2015><pubmed>25926358</pubmed></ref>（Rampon et al., 2015））。また、DMBとMHBの確立にはPbxとの協調も必要である（<ref name=Erickson2007><pubmed>16959235</pubmed></ref>（Erickson et al., 2007））。前述の通り、En1とEn2は機能的に冗長ではあるが（<ref name=Hanks1995><pubmed>7624797</pubmed></ref>（Hanks et al., 1995））、En1は小脳と上丘の発生にE9より前のみ必要であり（<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>（Sgaier et al., 2007））、En1の欠失によりE9.5までにMHB近傍で細胞死が増加する（Chi et al., 2003）。一方で、En1は下丘の、En2は小脳の発生において、より長期にわたり機能が要求される（<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>（Sgaier et al., 2007））。さらに、脳の領域化後においても、Enは中脳後脳領域内での勾配的または局所的な発現を通じて、領域内のパターン形成に寄与する。この機能は、神経回路形成、特定のニューロンの発生、および中脳後脳内における微細構造の形成に関与する（<ref name=Itasaki1991><pubmed>1811932</pubmed></ref>（Itasaki et al., 1991）; Millen et al., 1994, 1995; Kuemerle et al., 1997; Sgaier et al., 2005; Omi et al., 2014）。


＜神経回路形成における機能＞
=== 中脳後脳関連遺伝子間の初期胚における発現相互依存性 ===
　Enは、中脳視蓋の後方でより高いという前後軸方向の発現勾配を呈することにより、投射地図（トポグラフィックマップ）の前後軸の確立に寄与する（<ref name=Itasaki1996><pubmed>8625836</pubmed></ref>（Itasaki & Nakamura, 1996）; <ref name=Retaux1996><pubmed>8741378</pubmed></ref>（Rétaux et al., 1996）; <ref name=Friedman1996><pubmed>8625835</pubmed></ref>（Friedman & O’Leary, 1996））。これは、転写因子としてEnがEphrinA2やEphrinA5の前後軸方向の勾配を伴った発現を誘導することと（<ref name=Logan1996a><pubmed>8805331</pubmed></ref>（Logan et al., 1996）; <ref name=Shigetani1996><pubmed>8898227</pubmed></ref>（Shigetani et al., 1996））、En自身が分泌性因子として耳側網膜神経節細胞（RGC）軸索を反発する一方、鼻側軸索を誘引することにより達成される（<ref name=Brunet2005><pubmed>16193056</pubmed></ref>（Brunet et al., 2005））。成長円錐内部に移行したEnは、eIF4Eとの相互作用を介して、この軸索ガイダンス作用に必要な局所的翻訳を刺激する。この刺激によるラミンB2の翻訳促進が、ミトコンドリアの機能と軸索輸送に必要である（<ref name=Yoon2012><pubmed>22246438</pubmed></ref>（Yoon et al., 2012））。En2はまた、EphrinA5による軸索成長円錐の崩壊に関し、アデノシンA1受容体シグナル伝達依存的に、耳側RGCを感作する（<ref name=Wizenmann2009><pubmed>19503086</pubmed></ref>（Wizenmann et al., 2009）; <ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref>（Stettler et al., 2012））。この感作により、投射地図はより精密になる。
　脊椎動物初期胚の中脳後脳領域において''En1''と相前後して発現を開始し、協調して中脳、後脳の発生に関わる遺伝子として、''[[Wnt1]]''、''[[Pax2]]''、''[[Fgf8]]''が存在する。初期胚の脳において、''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''の異所的発現あるいは機能喪失は、''En1''の発現の変化を引き起こす<ref name=Shamim1999><pubmed>9927596</pubmed></ref><ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref><ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref><ref name=McMahon1992><pubmed>1534034</pubmed></ref><ref name=Danielian1996><pubmed>8848044</pubmed></ref><ref name=Lekven2003><pubmed>12591239</pubmed></ref><ref name=Ye2001><pubmed>11704761</pubmed></ref><ref name=Ye1998><pubmed>9630220</pubmed></ref><ref name=Liu1999><pubmed>10518499</pubmed></ref><ref name=Liu2003><pubmed>14602678</pubmed></ref>。同様に''En1''の異所的発現あるいは機能喪失は、''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''の発現の変化を引き起こす<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref><ref name=Shamim1999><pubmed>9927596</pubmed></ref><ref name=Ye2001><pubmed>11704761</pubmed></ref><ref name=Liu2001><pubmed>11124114</pubmed></ref><ref name=Picker2002><pubmed>12070097</pubmed></ref>。したがって、初期胚の中脳・後脳領域において、''En1''、''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''は互いの発現維持に相互依存している。一方で、それぞれの発現開始には関与しないことが示されている<ref name=McMahon1992><pubmed>1534034</pubmed></ref><ref name=Ye2001><pubmed>11704761</pubmed></ref><ref name=Liu2001><pubmed>11124114</pubmed></ref><ref name=Chi2003><pubmed>12736208</pubmed></ref>。ニワトリでは脊索で発現する''Fgf4''が中脳後脳領域における''En1''の発現を誘導することが提唱されているが、マウスやゼブラフィッシュの[[脊索]]における''Fgf4''の発現は報告されていない<ref name=Shamim1999><pubmed>9927596</pubmed></ref><ref name=Rhinn2001><pubmed>11179870</pubmed></ref>。
　脊髄では、En1はV1介在ニューロンの特定化には必要ないが、その軸索ガイダンスと軸索束形成に必要である（<ref name=Saueressig1999><pubmed>10457093</pubmed></ref>（Saueressig et al., 1999））。また、V1ニューロンの一部に由来するレンショー細胞と運動ニューロンの抑制性シナプス形成を調節する（<ref name=Sapir2004><pubmed>15537539</pubmed></ref>（Sapir et al., 2004））。


　発生中の体幹部において、軸上筋神経は体節中のEn1陽性領域に誘引される一方、軸下筋神経はEn陽性領域を忌避する（<ref name=Ahmed2017><pubmed>28860159</pubmed></ref>（Ahmed et al., 2017））。また、En1は肢芽腹側のアイデンティティー獲得に必要であるが（<ref name=Loomis1996><pubmed>8692975</pubmed></ref>（Loomis et al., 1996）; <ref name=Logan1997><pubmed>9052784</pubmed></ref>（Logan et al., 1997））、四肢背側の筋肉に投射する脊髄運動ニューロン軸索に対し、肢芽腹側のEn1は細胞間シグナル分子として直接的に反発効果を呈すると共に、転写因子として制御下のEphrinA5を介して間接的にも反発効果を示す（<ref name=Huettl2015><pubmed>25921065</pubmed></ref>（Huettl et al., 2015））。但し、中脳視蓋とは異なりEn1とEphrinA5との相乗効果は見られず、またEn2はこの軸索に対して反発効果を示さない。
　''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''は''En2'' mRNAおよびEn2タンパク質の発現維持にも関与する<ref name=Shamim1999><pubmed>9927596</pubmed></ref><ref name=Reifers1998><pubmed>9609821</pubmed></ref><ref name=Liu1999><pubmed>10518499</pubmed></ref><ref name=Sugiyama1998><pubmed>9572358</pubmed></ref><ref name=Okafuji1999><pubmed>10446345</pubmed></ref><ref name=Crossley1996><pubmed>8598907</pubmed></ref><ref name=Shimamura1997><pubmed>9226442</pubmed></ref><ref name=Sato2001><pubmed>11493563</pubmed></ref>。また､''Wnt1''および''Pax2''ノックアウトマウスでは''En2''が発現しないことが、''Pax2''変異ゼブラフィッシュでは''En1''が発現しないことが報告されており、これは''En2''（ゼブラフィッシュの場合は''En1''）の発現開始がそれらの遺伝子に依存することを示唆する<ref name=Lun1998><pubmed>9671579</pubmed></ref><ref name=McMahon1992><pubmed>1534034</pubmed></ref><ref name=Schwarz1999><pubmed>10354469</pubmed></ref>。


＜ニューロンの分化と維持における機能＞ 
　なお、''En''による''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''の誘導や、''Fgf8''による''En''の誘導は間接的であると考えられている<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref><ref name=Liu2003><pubmed>14602678</pubmed></ref>。
　En1、En2はmDAニューロンの維持に、細胞自律的に必要であり（<ref name=Simon2001><pubmed>11474113</pubmed></ref>（Simon et al., 2001）; <ref name=Alberi2004><pubmed>14701811</pubmed></ref>（Albéri et al., 2004））、LINE-1の発現抑制を通じて、酸化ストレスからmDAニューロンを保護する（<ref name=AlvarezFischer2011><pubmed>21315254</pubmed></ref>（Alvarez-Fischer et al., 2011）; <ref name=Rekaik2015><pubmed>26209848</pubmed></ref>（Rekaik et al., 2015）; <ref name=deThe2018><pubmed>29572484</pubmed></ref>（de Thé et al., 2018））。また、En1は上オリーブ核ニューロンの、En1、En2は共に小脳核内側の一部の興奮性ニューロンおよび縫線核5-HTニューロンの分化と維持に必要である（<ref name=Altieri2015><pubmed>25698749</pubmed></ref>（Altieri et al., 2015）; <ref name=Krishnamurthy2024><pubmed>38308463</pubmed></ref>（Krishnamurthy et al., 2024）; <ref name=Fox2012><pubmed>22219263</pubmed></ref>（Fox & Deneris, 2012））。更に、En2は大脳基底核由来神経幹細胞からのGABA作動性ニューロンの分化に必要である（<ref name=Boschian2018><pubmed>29656876</pubmed></ref>（Boschian et al., 2018））。加えて、En1およびEn2は培養海馬細胞の樹状突起の複雑度やシナプスに差次的に影響する（<ref name=Soltani2017><pubmed>28408414</pubmed></ref>（Soltani et al., 2017））。 
　マウス成体の脊髄のV1介在ニューロンで発現するEn1は、α運動ニューロンに対し傍分泌性の神経栄養活性を有する（<ref name=Leboeuf2023><pubmed>36740498</pubmed></ref>（Lebœuf et al., 2023））。


＜脊椎動物の神経系以外での機能＞ 
=== 中期発生以降の神経系における発現 ===
　En1は頭蓋冠における頭部沿軸中胚葉細胞集団と神経堤細胞集団の境界の位置決めに寄与する一方、冠状縫合前駆細胞における骨形成を周囲の骨前駆細胞よりも遅延させるようである（<ref name=Deckelbaum2012><pubmed>22434611</pubmed></ref>（Deckelbaum et al., 2012））。また、皮筋節における褐色脂肪細胞の発生を促進する（<ref name=Zhang2016><pubmed>27453576</pubmed></ref>（Zhang et al., 2016））。 
　発生初期の脳の領域化以降も、主として中脳や小脳において''En''の発現が見られる。マウスにおいて、''En1''および''En2''が中脳[[ドーパミン]]ニューロンにおいて、また''En1''が[[上オリーブ核]]の[[グリシン]]作動性、[[コリン]]作動性および[[GABA]]作動性ニューロンにおいて、胚発生期から成体まで発現する<ref name=Simon2001><pubmed>11312297</pubmed></ref><ref name=Altieri2015><pubmed>26542008</pubmed></ref>。また、[[縫線核]]では''En1''および''En2''が5-HTニューロンで胚発生期に発現し、En1の発現は出生後も継続する<ref name=Fox2012><pubmed>22674259</pubmed></ref>。胚発生15.5日目（E15.5）〜出生後0日目（P0）のマウス胚小脳では、[[苔状線維]]と[[登上線維]]の神経支配と合致した''En2''の縞状の発現が見られる<ref name=Millen1995><pubmed>8575294</pubmed></ref>。


＜無脊椎動物の神経系における役割＞ 
　マウス海馬ではE16以降、''En1''および''En2''が低レベルで発現し、シナプス形成が盛んに起こる出生時および生後1週間の間に、''En2''の発現は激減する<ref name=Soltani2017><pubmed>28809922</pubmed></ref>。
　節足動物においてもenは、神経細胞分化や神経回路形成に関わることが知られている（<ref name=Condron1994><pubmed>8050370</pubmed></ref>（Condron et al., 1994）; <ref name=Lundell1996><pubmed>8787747</pubmed></ref>（Lundell et al., 1996）; <ref name=Bhat1997><pubmed>9053461</pubmed></ref>（Bhat & Schedl, 1997）; <ref name=Marie2000><pubmed>10887089</pubmed></ref>（Marie et al., 2000）; <ref name=Marie2002><pubmed>12175511</pubmed></ref>（Marie et al., 2002）; <ref name=Joly2007><pubmed>17609121</pubmed></ref>（Joly et al., 2007））。


・疾患との関連 
　ニワトリでは、孵卵開始10日目の中脳視蓋において[[浅灰白線維層]]（SGFS）のg〜j層と[[脳室帯]]でEn2の発現が見られ、特にSGFSのi層で発現が高い<ref name=Omi2014><pubmed>24803658</pubmed></ref>。また、この時期でも中脳視蓋後方から前方にかけての発現勾配が見られる。
　En1+/-マウスあるいはEn1+/-; En2-/-マウスは、ヒトのパーキンソン病に特徴的なドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失や運動障害を示す（<ref name=Sgado2006><pubmed>16445986</pubmed></ref>（Sgadò et al., 2006）; <ref name=Sonnier2007><pubmed>17582657</pubmed></ref>（Sonnier et al. 2007）; <ref name=AlvarezFischer2011><pubmed>21240157</pubmed></ref>（Alvarez-Fischer et al., 2011）; <ref name=Nordstrom2015><pubmed>25782438</pubmed></ref>（Nordstroma et al., 2015））。カニクイザルのパーキンソン病モデルの黒質緻密部へのEN1タンパク質の注入による治療効果が報告されている（<ref name=Thomasson2019><pubmed>31097624</pubmed></ref>（Thomasson et al., 2019））。EN1のいくつかのSNPは統合失調症の症状および症状に対する抗精神病薬の効果と関連する（<ref name=Webb2008><pubmed>18663369</pubmed></ref>（Webb et al., 2008））。 
　En1陽性繊維芽細胞は、胚発生や創傷治癒、放射線線維症、腫瘍間質形成における結合組織沈着に寄与する（<ref name=Rinkevich2015><pubmed>25915128</pubmed></ref>（Rinkevich et al., 2015））。EN1は全身性強皮症患者の皮膚で発現が上昇しており、TGFβによる筋線維芽細胞分化を増強する（<ref name=Gyorfi2021><pubmed>33432192</pubmed></ref>（Györfi et al., 2021））。マウスにおいて繊維芽細胞でEn1の活性化を阻害すると瘢痕無しに創傷が治癒する（<ref name=Mascharak2021><pubmed>34282238</pubmed></ref>（Mascharak et al., 2021））。 
　EN1は腺様嚢胞癌、トリプルネガティブ乳癌、神経膠腫、上咽頭癌、骨肉腫の予後不良と関連する（<ref name=Frerich2018><pubmed>30089597</pubmed></ref>（Frerich et al., 2018）; <ref name=Beltran2014><pubmed>25277632</pubmed></ref>（Beltran et al., 2014）; <ref name=Qin2020><pubmed>32772671</pubmed></ref>（Qin et al., 2020）; <ref name=Wiggins2021><pubmed>33910995</pubmed></ref>（Wiggins et al.; 2021）; <ref name=Kim2018><pubmed>29467286</pubmed></ref>（Kim et al., 2018）; <ref name=Peluffo2019><pubmed>30833635</pubmed></ref>（Peluffo et al., 2019）; <ref name=Zhu2019><pubmed>31022872</pubmed></ref>（Zhu & Zhang, 2019））。EN1は転写抑制因子として膵管腺癌の転移を促進する（<ref name=Xu2023><pubmed>37693309</pubmed></ref>（Xu et al., 2023））。 
　EN2の多型と自閉スペクトラム症（ASD）との関連は1995年に最初に示された（<ref name=Petit1995><pubmed>7633405</pubmed></ref>（Petit et al., 1995））。EN2はASD患者で過剰発現する（<ref name=Choi2011><pubmed>21653593</pubmed></ref>（Choi et al., 2011）; <ref name=James2014><pubmed>24958501</pubmed></ref>（James et al., 2014））。また、ASDに関連するEN2のイントロン中の2つのSNPは、発現上昇に繋がる（<ref name=Benayed2009><pubmed>19189976</pubmed></ref>（Benayed et al., 2009））。En2欠損マウスはASD患者と似た行動、学習の障害や、小脳の形態異常を示す（<ref name=Cheh2006><pubmed>17108008</pubmed></ref>（Cheh et al., 2006）; <ref name=Kuemerle2007><pubmed>17347341</pubmed></ref>（Kuemerle et al., 2007））。また、ASD患者において味覚異常が報告されているが、En2欠損マウスでも塩化ナトリウムへの嗜好性が強まる（<ref name=Gupta2018><pubmed>29524259</pubmed></ref>（Gupta et al., 2018））。ASD成人患者に対する慢性ストレスが、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型を増悪するかどうかは明らかで無いが、慢性的な環境ストレスに曝露したEn2欠損マウスでは、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型が増悪することが報告されている（<ref name=Phan2021><pubmed>33404720</pubmed></ref>（Phan et al., 2021））。 
　EN2を非腫瘍性乳腺細胞株で過剰発現すると、細胞が悪性化する（<ref name=Martin2005><pubmed>16179391</pubmed></ref>（Martin et al., 2005））。EN2は前立腺癌や膀胱癌で発現し、尿中のEN2は診断や予後のバイオマーカーとなる（<ref name=Morgan2011><pubmed>21858046</pubmed></ref>（Morgan et al., 2011）; <ref name=Pandha2012><pubmed>22471839</pubmed></ref>（Pandha et al., 2012）; <ref name=Pandha2013><pubmed>23738799</pubmed></ref>（Pandha et al., 2013）; <ref name=Morgan2013><pubmed>23471578</pubmed></ref>（Morgan et al., 2013）; <ref name=Marszall2015><pubmed>25985366</pubmed></ref>（Marszall et al., 2015））。


参考文献
== 機能 ==
=== 分子としての機能 ===
　Enは、転写抑制因子としても[[転写活性化因子]]としても機能する<ref name=Tolkunova1998><pubmed>9566899</pubmed></ref><ref name=Smith1996><pubmed>8898227</pubmed></ref><ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref><ref name=Serrano1998><pubmed>9649440</pubmed></ref>。また直接的に転写活性化因子として機能する他、別の転写抑制因子を抑制することにより間接的に転写活性化を引き起こす可能性がある<ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref>。Enによる転写抑制には[[転写抑制補助因子]]Groが必要である<ref name=Hittinger1997><pubmed>9367988</pubmed></ref>。更に、Enの転写抑制活性は、Ext/PbxおよびHth/Meisとヘテロ三量体を形成することにより増強される<ref name=Kobayashi2003><pubmed>12506004</pubmed></ref>。
 
　また、Enは、非典型的分泌経路を介して細胞間シグナル分子としても機能する<ref name=Joliot1998><pubmed>9705930</pubmed></ref><ref name=Maizel1999><pubmed>10375508</pubmed></ref><ref name=Dupont2007><pubmed>17242404</pubmed></ref>。
 
　更に、EnはeIF4Eに結合し、タンパク質合成を刺激することが、E17のマウス胚背側[[上丘]]において示されている<ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref>。この刺激により[[ミトコンドリア]][[呼吸鎖]][[複合体I]]を構成する[[Ndufs3]]の翻訳が促進され、[[ATP]]合成が増加し、それに引き続くATPの分泌と[[アデノシン]]への加水分解を経てアデノシン[[A1受容体]]が活性化される。
 
=== 転写の標的遺伝子 ===
　脊椎動物では、神経系におけるEnの標的遺伝子として、[[微小管結合タンパク質1b]]、および[[長鎖散在反復配列]][[LINE-1]]がin vivoで同定されている<ref name=Foucher2003><pubmed>12642491</pubmed></ref><ref name=deThe2018><pubmed>29941661</pubmed></ref>。また、ニワトリ初期胚の脳において、''Pax6''が標的遺伝子の候補として同定されている<ref name=Araki1999></ref>。
 
　脊椎動物の初期胚の脳における、''En''による''Wnt1''、''Pax2''、''Fgf8''の誘導は直接的なものではないことを先に述べたが、同様に、''En''による[[軸索ガイダンス]]や細胞のソーティングに関わる細胞表面タンパク質をコードする[[EphrinA2]]や[[EphrinA5]]の発現誘導も<ref name=Logan1996><pubmed>8805331</pubmed></ref><ref name=Shigetani1996><pubmed>9129179</pubmed></ref><ref name=Lee1997><pubmed>9056772</pubmed></ref>、間接的な制御であると推定される<ref name=Araki1999></ref>。
 
=== 中脳および後脳の初期発生 ===
　初期胚において、''En1''と''En2''は、中脳後脳境界オーガナイザーの維持や、[[中脳間脳境界]]（[[diencephalic–mesencephalic boundary]],[[DMB]]）の確立と維持を通じて、発生中の脳の領域化に寄与する<ref name=Joyner1991><pubmed>1672471</pubmed></ref><ref name=Araki1999><pubmed>10529429</pubmed></ref><ref name=Wurst1994><pubmed>7925010</pubmed></ref><ref name=Joyner1996><pubmed>8741855</pubmed></ref><ref name=Matsunaga2000><pubmed>10804178</pubmed></ref><ref name=Scholpp2003><pubmed>12917294</pubmed></ref>。脳の領域化においてEnは専ら転写因子として機能し、細胞間シグナル分子としての役割は小さい、とする報告がある一方<ref name=Lesaffre2007><pubmed>17229313</pubmed></ref>、中脳間脳境界の確立にはEnが分泌されることが必要であることも示されている<ref name=Rampon2015><pubmed>25926358</pubmed></ref>。また、中脳間脳境界と中脳後脳境界の確立にはPbxとの協調も必要である<ref name=Erickson2007><pubmed>16959235</pubmed></ref>。前述の通り、''En1''と''En2''は機能的に冗長ではあるが<ref name=Hanks1995></ref>、''En1''は小脳と上丘の発生にE9より前のみ必要であり<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>、''En1''の欠失によりE9.5までに中脳後脳境界近傍で[[細胞死]]が増加する<ref name=Chi2003><pubmed>12736208</pubmed></ref>。一方で、''En1''は[[下丘]]の、''En2''は小脳の発生において、より長期にわたり機能が要求される<ref name=Sgaier2007><pubmed>17537797</pubmed></ref>。さらに、[[脳の領域化]]後においても、''En''は中脳後脳領域内での勾配的または局所的な発現を通じて、領域内のパターン形成に寄与する。この機能は、神経回路形成、特定のニューロンの発生、および中脳後脳内における微細構造の形成に関与する<ref name=Sgaier2005></ref><ref name=Itasaki1991><pubmed>1811932</pubmed></ref><ref name=Millen1995><pubmed>8575294</pubmed></ref><ref name=Omi2014><pubmed>24803658</pubmed></ref>。
 
=== 神経回路形成 ===
　Enは、中脳視蓋の後方でより高いという[[前後軸]]方向の発現勾配を呈することにより、[[投射地図]]（[[トポグラフィックマップ]]）の前後軸の確立に寄与する<ref name=Itasaki1996><pubmed>8562091</pubmed></ref><ref name=Retaux1996><pubmed>8562092</pubmed></ref><ref name=Friedman1996><pubmed>8757262</pubmed></ref>。これは、転写因子として''En''がEphrinA2やEphrinA5の前後軸方向の勾配を伴った発現を誘導することと<ref name=Logan1996><pubmed>8805331</pubmed></ref><ref name=Shigetani1996><pubmed>9129179</pubmed></ref>、En自身が分泌性因子として耳側[[網膜神経節細胞]]（[[retinal ganglion cell]]s, [[RGC]]）軸索を反発する一方、鼻側軸索を誘引することにより達成される<ref name=Brunet2005><pubmed>16267555</pubmed></ref>。[[成長円錐]]内部に移行したEnは、eIF4Eとの相互作用を介して、この軸索ガイダンス作用に必要な局所的翻訳を刺激する。この刺激による[[ラミンB2]]の翻訳促進が、ミトコンドリアの機能と軸索輸送に必要である<ref name=Yoon2012><pubmed>22341447</pubmed></ref>。En2はまた、EphrinA5による軸索成長円錐の崩壊に関し、アデノシンA1受容体シグナル伝達依存的に、耳側網膜神経節細胞を感作する<ref name=Stettler2012><pubmed>22147955</pubmed></ref><ref name=Wizenmann2009><pubmed>19914184</pubmed></ref>。この感作により、投射地図はより精密になる。
 
　[[脊髄]]では、''En1''はV1介在ニューロンの特定化には必要ないが、その軸索ガイダンスと軸索束形成に必要である<ref name=Saueressig1999><pubmed>10477289</pubmed></ref>。また、V1ニューロンの一部に由来する[[レンショー細胞]]と[[運動ニューロン]]の抑制性シナプス形成を調節する<ref name=Sapir2004><pubmed>14762144</pubmed></ref>。
 
　発生中の体幹部において、軸上筋神経は体節中の''En1''陽性領域に誘引される一方、軸下筋神経は''En''陽性領域を忌避する<ref name=Ahmed2017><pubmed>28807781</pubmed></ref>。また、四肢背側の筋肉に投射する脊髄運動ニューロン軸索に対し、肢芽腹側のEn1は細胞間シグナル分子として直接的に反発効果を呈すると共に、転写因子として制御下のEphrinA5を介して間接的にも反発効果を示す<ref name=Huettl2015><pubmed>25710467</pubmed></ref>。但し、中脳視蓋とは異なりEn1とEphrinA5との相乗効果は見られず、またEn2はこの軸索に対して反発効果を示さない。
 
=== ニューロンの分化と維持 ===
　''En1''、''En2''は中脳ドーパミンニューロンの維持に、細胞自律的に必要であり<ref name=Simon2001><pubmed>11312297</pubmed></ref><ref name=Alberi2004><pubmed>15175251</pubmed></ref>、LINE-1の発現抑制を通じて、[[酸化ストレス]]から中脳ドーパミンニューロンを保護する<ref name=deThe2018><pubmed>29941661</pubmed></ref><ref name=Alvarez2011><pubmed>21892157</pubmed></ref>。また、''En1''は上オリーブ核ニューロンの、''En1''、''En2''は共に[[小脳核]]内側の一部の[[興奮性ニューロン]]および縫線核[[5-HT]]ニューロンの分化と維持に必要である<ref name=Altieri2015><pubmed>26542008</pubmed></ref><ref name=Fox2012><pubmed>22674259</pubmed></ref><ref name=Krishnamurthy2024><pubmed>38912572</pubmed></ref>。更に、''En2''は[[大脳基底核]]由来[[神経幹細胞]]からのGABA作動性ニューロンの分化に必要である<ref name=Boschian2018><pubmed>29964155</pubmed></ref>。加えて、En1およびEn2は[[培養海馬細胞]]の樹状突起の複雑度やシナプスに差次的に影響する<ref name=Soltani2017><pubmed>28809922</pubmed></ref>。
 
　マウス成体の脊髄のV1介在ニューロンで発現するEn1は、[[α運動ニューロン]]に対し[[傍分泌性]]の[[神経栄養活性]]を有する<ref name=Leboeuf2023><pubmed>37534581</pubmed></ref>。
 
== 疾患との関連 ==
=== パーキンソン病 ===
　''En1''+/-マウスあるいは''En1''+/-; ''En2''-/-マウスは、ヒトの[[パーキンソン病]]に類似したドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失や運動障害を示す<ref name=Alvarez2011><pubmed>21892157</pubmed></ref><ref name=Sgado2006><pubmed>17015829</pubmed></ref>。[[カニクイザル]]のパーキンソン病モデルの[[黒質緻密部]]へのEN1タンパク質の注入による治療効果が報告されている<ref name=Thomasson2019><pubmed>31077447</pubmed></ref>。
 
=== 自閉スペクトラム症 ===
　''EN2''の多型と[[自閉スペクトラム症]]との関連は1995年に最初に示された<ref name=Petit1995><pubmed>7643354</pubmed></ref>。''EN2''は患者で過剰発現する<ref name=James2014><pubmed>25290267</pubmed></ref>。また、自閉スペクトラム症に関連する''EN2''のイントロン中の2つのSNPは、発現上昇に繋がる<ref name=Benayed2009><pubmed>19615670</pubmed></ref>。''En2''欠損マウスは患者と類似した行動、および学習の障害や、小脳の形態異常を示す<ref name=Cheh2006><pubmed>16935268</pubmed></ref>。また、患者において[[味覚]]異常が報告されているが、''En2''欠損マウスでも[[塩化ナトリウム]]への嗜好性が強まる<ref name=Gupta2018><pubmed>29953887</pubmed></ref>。成人患者に対する慢性ストレスが、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型を増悪するかどうかは明らかで無いが、慢性的な[[環境ストレス]]に曝露した''En2''欠損マウスでは、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型が増悪することが報告されている<ref name=Phan2021><pubmed>34271036</pubmed></ref>。
 
=== 統合失調症 ===
　''EN1''のいくつかの[[単一塩基多型]]は[[統合失調症]]の症状および[[抗精神病薬]]の効果と関連する<ref name=Webb2008><pubmed>18698228</pubmed></ref>。
 
== 参考文献 ==

2025年10月6日 (月) 16:08時点における最新版

荒木 功人
岩手大学 農学部
DOI:10.14931/bsd.11378　原稿受付日:2025年6月23日　原稿完成日:2025年9月26日
担当編集委員:山形 方人（ハーバード大学・脳科学センター）

英略称：En

　Engrailed（En）遺伝子は、動物界で広く見られるホメオドメインタンパク質Enをコードする。Enは、転写因子としての機能を持つほか、古典的なシグナルペプチドを持たないにも拘わらずその一部は細胞外に分泌され、更に細胞外から他の細胞内へ移行できるという細胞間シグナル分子としての性質も有する。加えて、eIF4Eに結合し翻訳を促進するという翻訳調節因子としての側面も持つ。脊椎動物は、Engrailed-1（En1）およびEngrailed-2（En2）の2つのパラログを有しており、これらは中脳—後脳境界の形成、小脳および中脳の発生、神経回路の構築、神経細胞の分化や生存維持において重要な役割を果たす。EN2は自閉スペクトラム症との関連が示されている一方、En1ヘテロ接合性マウスはパーキンソン病に特徴的なドーパミンニューロン減少と運動制御異常を示す。

研究の歴史

　1920年代後半の研究により、ショウジョウバエの最初のengrailed（en）変異体が樹立された[1]。その後の研究により、enは翅原基の後部コンパートメント形成や[2]、セグメントポラリティー遺伝子の一つとして胚の体節化[3]に関与することなどが明らかになった。1985年には、ショウジョウバエのen遺伝子のcDNA配列が決定され、それがホメオボックス遺伝子であることが判明した[4][5]。更に、脊椎動物を含む他の動物分類群においてen相同遺伝子の単離と解析が進んだ[6][7][8][9]。

サブファミリー

無脊椎動物

　多くは単一のenを有する一方、ショウジョウバエには、enと隣接してそのパラログ遺伝子であるinvected（inv）が存在する[10]。invを欠く個体は生存可能であり、表現型にも顕著な異常は見られないが、enとinvの二重変異体ではen単独変異の表現型が増強されることから、両者は機能的に冗長であると考えられる[10]。

脊椎動物

　多くは2つのen相同遺伝子En1およびEn2を有する[7]。ゼブラフィッシュでは、それぞれの遺伝子がさらに重複し、En1およびEn2が各2コピーずつ存在する[11]。

　En1遺伝子座にEn2をノックインしたマウスの解析によると、En1とEn2は機能的に冗長である[12]。一方、En1遺伝子座にショウジョウバエのenをノックインしたマウスでは、四肢の表現型のみが見られる[13]。このノックインマウスからさらに内在性En2を除去すると中脳と小脳の発生に異常が生ずる[14]。これは、En2のみを欠くマウスが小脳に小さな欠損を呈するものの生存可能かつ生殖可能であるのと対照的である[15]。

図1. Engrailedタンパク質の構造
ニワトリEn2をモデルとして示す。緑は高セリン領域を示す。薄紫のバーはホメオドメイン（HD）中のαヘリックスを示す[16]。4D9はEnに関する研究でしばしば用いられるモノクローナル抗体であり、本図ではそのエピトープが含まれる領域を示す[17]。ショウジョウバエEnではCATアッセイによりEH1とEH2の間の一部の領域（アミノ酸228〜282）が転写抑制活性を有することが示されているが[18]、この領域は脊椎動物のEnとの相同性は見られない。(*) MeisはEnに直接結合するが、Enのどの部分に結合するかは不明である。

構造

遺伝子およびmRNA

　代表的な脊椎動物種のEn1およびEn2の多くは、2つのエキソンと1つのイントロンから成る[19]。

　En1 mRNAの3'UTRには細胞質ポリアデニル化配列（CPE）が存在することから、その樹状突起への局在はCPE結合タンパク質により調節される可能性がある[20]。in vitroにおけるEn1 mRNAの翻訳は、ポリアデニル化に依存して脱分極により増加し、この翻訳はラパマイシンにより阻害される。またEn2はmiR-212の標的である[21]。

タンパク質

　Loganら[19]は、ショウジョウバエのEngrailed（En）、マウス、ヒト、ニワトリのEn1, En2およびアフリカツメガエルのEn2のアミノ酸配列を比較することにより、Enタンパク質において進化的に保存されている5つの領域を同定し、それぞれをEH1〜EH5と名付けた(図1)。CATアッセイによると、このうちEH1とEH5はEngrailedの転写抑制活性に関わる[22]。

　EH1は、Enを初めとするホメオドメインタンパク質やフォークヘッドタンパク質、Tボックスタンパク質、Znフィンガータンパク質などにおいても見られるアミノ酸モチーフであり[23]、転写抑制補助因子であるGroucho（Gro）/Tleが結合する[22][24]。in vivoで、EH1のみに変異を入れるだけでEnの転写抑制活性が失われる[23][25]。ショウジョウバエのEnには、EH1とEH2の間（アミノ酸201〜205）に昆虫特有のGro結合部位（ehIFRPFモチーフ）が、EH1とは別に存在する[26]。

　EH2およびEH3にはTALEホメオドメインタンパク質に属する転写補助因子Extradenticle（Exd）/Pbxが結合する[27]。特にEH2内の2つのトリプトファンの何れかをリジンに置換するとPbxと結合できなくなる[28]。また、この置換によりEnは、細胞外に移行できなくなる[29]。他のホメオドメインタンパク質と同様、EnはExd/Pbxの他、Homothorax (Hth)/Meisとヘテロ三量体を形成する。結合部位の詳細は不明であるが、Hth/MeisはEnに直接結合するとされる[30]。EH2のC末端の2つのアミノ酸とEH3全体は核移行シグナル (NLS)であると推定されている[22][31]。また、EH2中のシステイン残基は、酸化還元調節に応じたEn2の細胞間シグナル伝達の調節に関与する[32]。

　EH4はホメオドメインであり、DNAへの結合に関わる[16]。ホメオドメインを構成する3本のαヘリックスのうち第3ヘリックスと、ホメオドメインのN末端のヘリックスを構成しない数アミノ酸がDNAに結合する[16]。SAAB法によるとEngrailed単独で最も高い親和性を示すDNA配列はTAATTAである[33]。また、Exdとのヘテロ二量体化により、EnのDNA結合特異性が変化する[34]。ショウジョウバエ胚におけるChIP解析によるとEnのコンセンサス結合配列はYAATYANBである[35]。Enの結合親和性は、認識部位に隣接する、認識配列に類似した繰り返し配列を伴うDNA領域により増強される[36]。

　EH3の大部分とホメオドメインのN末端の一部を含む領域は、細胞表面のグリコサミノグリカン（GAG）との相互作用を通じて、Enの細胞外から細胞内への移行を制御する[31]。ホメオドメインのC末端側には、核外移行シグナル配列（NES）/細胞外への分泌シグナルと、細胞外から細胞内への移行シグナル（膜透過ペプチド配列penetratin）が存在する[37][38][39]。細胞外から細胞内への移行はエンドサイトーシスと、エンドサイトーシスを介さない直接的移行の2つの様式により起こる[39][40]。Enの細胞内外への出入りには、ホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸（PIP2）とコレステロールが必要である[41]。EnのEH2ドメインのN末端側には高セリン領域が存在する。カゼインキナーゼ2 (CK2)によるこの領域のリン酸化は、EnホメオドメインのDNAへの結合を増強する一方[42]、Enの細胞外分泌を阻害する[43]。また、Enは他のいくつかのホメオドメインタンパク質（Bicoid, Emx2, HoxA9, Prhなど）と同様に、真核生物翻訳開始因子4E (eIF4E)と結合するが[44]、それらのホメオドメインタンパク質とは異なり[45]、EH1ドメインがeIF4E結合部位を兼ねることが推定されている（[46]、Alain Prochiantz、私信）。これとは別に、マウスのEn1のホメオドメインN末端に位置するリジンに点突然変異K313Eを導入すると、eIF4Eに結合しなくなる[47]。Foxa2との相互作用には高セリン領域からホメオドメインにかけての領域が関与する[48]。

発現

細胞内分布

　Enを発現させたCOS細胞において、細胞内のEnのうち、細胞外へ出るのは5%未満であると見積もられており、その大部分は核に局在する[37]。Enはいくつかのニューロンにおいて樹状突起など核外に局在することが報告されている[20][44]。ゼブラフィッシュ胚中脳視蓋において、H2O2レベルが増加するとEn2の核への移行が促進される[32]。

初期胚の神経系における主な発現

　脊椎動物の初期胚では、En1、En2のmRNAおよびそれらのタンパク質の発現が中脳から第1菱脳胞（ロンボメア1）にかけて見られる[11][12][17][49][50][51][52][53][54]。En1 mRNAおよびEn1タンパク質陽性領域は発現初期には中脳前端まで至り、のちに発現領域は中脳後脳境界（midbrain–hindbrain boundary, MHB）付近に限られるようになる[49][50][51][52][55]。発現の時期には種差があり、マウスやニワトリではEn1の発現が先行する一方、ゼブラフィッシュではEn2の発現が先行する[56][57][58]。発生が進むとEn2タンパク質は中脳視蓋で前方から後方に向かって発現レベルが上昇する勾配を呈するようになる[59]。ゼブラフィッシュ胚において、H2O2レベルを上昇させると中脳視蓋におけるEn2タンパク質の発現勾配がより急になること、En2はH2O2が高レベルの細胞から分泌され、低レベルの細胞に取り込まれること、En2が細胞に取り込まれるとH2O2レベルが上昇することが報告されている[32]。

　また、脊髄から後脳後部にかけての腹側介在ニューロンでもEn1 mRNAおよびEn1タンパク質が発現する[11][12][49][51][53][54]。マウスでは、このEn1陽性介在ニューロンは、脊髄のPax2陽性介在ニューロンの一部であり、その発生はPax6に依存する[60][61]。

中脳後脳関連遺伝子間の初期胚における発現相互依存性

　脊椎動物初期胚の中脳後脳領域においてEn1と相前後して発現を開始し、協調して中脳、後脳の発生に関わる遺伝子として、Wnt1、Pax2、Fgf8が存在する。初期胚の脳において、Wnt1、Pax2、Fgf8の異所的発現あるいは機能喪失は、En1の発現の変化を引き起こす[55][56][57][62][63][64][65][66][67][68]。同様にEn1の異所的発現あるいは機能喪失は、Wnt1、Pax2、Fgf8の発現の変化を引き起こす[25][55][65][69][70]。したがって、初期胚の中脳・後脳領域において、En1、Wnt1、Pax2、Fgf8は互いの発現維持に相互依存している。一方で、それぞれの発現開始には関与しないことが示されている[62][65][69][71]。ニワトリでは脊索で発現するFgf4が中脳後脳領域におけるEn1の発現を誘導することが提唱されているが、マウスやゼブラフィッシュの脊索におけるFgf4の発現は報告されていない[55][58]。

　Wnt1、Pax2、Fgf8はEn2 mRNAおよびEn2タンパク質の発現維持にも関与する[55][56][67][72][73][74][75][76]。また､Wnt1およびPax2ノックアウトマウスではEn2が発現しないことが、Pax2変異ゼブラフィッシュではEn1が発現しないことが報告されており、これはEn2（ゼブラフィッシュの場合はEn1）の発現開始がそれらの遺伝子に依存することを示唆する[57][62][77]。

　なお、EnによるWnt1、Pax2、Fgf8の誘導や、Fgf8によるEnの誘導は間接的であると考えられている[25][68]。

中期発生以降の神経系における発現

　発生初期の脳の領域化以降も、主として中脳や小脳においてEnの発現が見られる。マウスにおいて、En1およびEn2が中脳ドーパミンニューロンにおいて、またEn1が上オリーブ核のグリシン作動性、コリン作動性およびGABA作動性ニューロンにおいて、胚発生期から成体まで発現する[78][79]。また、縫線核ではEn1およびEn2が5-HTニューロンで胚発生期に発現し、En1の発現は出生後も継続する[80]。胚発生15.5日目（E15.5）〜出生後0日目（P0）のマウス胚小脳では、苔状線維と登上線維の神経支配と合致したEn2の縞状の発現が見られる[81]。

　マウス海馬ではE16以降、En1およびEn2が低レベルで発現し、シナプス形成が盛んに起こる出生時および生後1週間の間に、En2の発現は激減する[82]。

　ニワトリでは、孵卵開始10日目の中脳視蓋において浅灰白線維層（SGFS）のg〜j層と脳室帯でEn2の発現が見られ、特にSGFSのi層で発現が高い[83]。また、この時期でも中脳視蓋後方から前方にかけての発現勾配が見られる。

機能

分子としての機能

　Enは、転写抑制因子としても転写活性化因子としても機能する[22][23][25][84]。また直接的に転写活性化因子として機能する他、別の転写抑制因子を抑制することにより間接的に転写活性化を引き起こす可能性がある[25]。Enによる転写抑制には転写抑制補助因子Groが必要である[85]。更に、Enの転写抑制活性は、Ext/PbxおよびHth/Meisとヘテロ三量体を形成することにより増強される[30]。

　また、Enは、非典型的分泌経路を介して細胞間シグナル分子としても機能する[37][38][39]。

　更に、EnはeIF4Eに結合し、タンパク質合成を刺激することが、E17のマウス胚背側上丘において示されている[47]。この刺激によりミトコンドリア呼吸鎖複合体Iを構成するNdufs3の翻訳が促進され、ATP合成が増加し、それに引き続くATPの分泌とアデノシンへの加水分解を経てアデノシンA1受容体が活性化される。

転写の標的遺伝子

　脊椎動物では、神経系におけるEnの標的遺伝子として、微小管結合タンパク質1b、および長鎖散在反復配列LINE-1がin vivoで同定されている[48][86]。また、ニワトリ初期胚の脳において、Pax6が標的遺伝子の候補として同定されている[25]。

　脊椎動物の初期胚の脳における、EnによるWnt1、Pax2、Fgf8の誘導は直接的なものではないことを先に述べたが、同様に、Enによる軸索ガイダンスや細胞のソーティングに関わる細胞表面タンパク質をコードするEphrinA2やEphrinA5の発現誘導も[52][87][88]、間接的な制御であると推定される[25]。

中脳および後脳の初期発生

　初期胚において、En1とEn2は、中脳後脳境界オーガナイザーの維持や、中脳間脳境界（diencephalic–mesencephalic boundary,DMB）の確立と維持を通じて、発生中の脳の領域化に寄与する[15][25][89][90][91][92]。脳の領域化においてEnは専ら転写因子として機能し、細胞間シグナル分子としての役割は小さい、とする報告がある一方[93]、中脳間脳境界の確立にはEnが分泌されることが必要であることも示されている[29]。また、中脳間脳境界と中脳後脳境界の確立にはPbxとの協調も必要である[28]。前述の通り、En1とEn2は機能的に冗長ではあるが[12]、En1は小脳と上丘の発生にE9より前のみ必要であり[14]、En1の欠失によりE9.5までに中脳後脳境界近傍で細胞死が増加する[71]。一方で、En1は下丘の、En2は小脳の発生において、より長期にわたり機能が要求される[14]。さらに、脳の領域化後においても、Enは中脳後脳領域内での勾配的または局所的な発現を通じて、領域内のパターン形成に寄与する。この機能は、神経回路形成、特定のニューロンの発生、および中脳後脳内における微細構造の形成に関与する[50][59][81][83]。

神経回路形成

　Enは、中脳視蓋の後方でより高いという前後軸方向の発現勾配を呈することにより、投射地図（トポグラフィックマップ）の前後軸の確立に寄与する[94][95][96]。これは、転写因子としてEnがEphrinA2やEphrinA5の前後軸方向の勾配を伴った発現を誘導することと[52][87]、En自身が分泌性因子として耳側網膜神経節細胞（retinal ganglion cells, RGC）軸索を反発する一方、鼻側軸索を誘引することにより達成される[97]。成長円錐内部に移行したEnは、eIF4Eとの相互作用を介して、この軸索ガイダンス作用に必要な局所的翻訳を刺激する。この刺激によるラミンB2の翻訳促進が、ミトコンドリアの機能と軸索輸送に必要である[98]。En2はまた、EphrinA5による軸索成長円錐の崩壊に関し、アデノシンA1受容体シグナル伝達依存的に、耳側網膜神経節細胞を感作する[47][99]。この感作により、投射地図はより精密になる。

　脊髄では、En1はV1介在ニューロンの特定化には必要ないが、その軸索ガイダンスと軸索束形成に必要である[100]。また、V1ニューロンの一部に由来するレンショー細胞と運動ニューロンの抑制性シナプス形成を調節する[101]。

　発生中の体幹部において、軸上筋神経は体節中のEn1陽性領域に誘引される一方、軸下筋神経はEn陽性領域を忌避する[102]。また、四肢背側の筋肉に投射する脊髄運動ニューロン軸索に対し、肢芽腹側のEn1は細胞間シグナル分子として直接的に反発効果を呈すると共に、転写因子として制御下のEphrinA5を介して間接的にも反発効果を示す[103]。但し、中脳視蓋とは異なりEn1とEphrinA5との相乗効果は見られず、またEn2はこの軸索に対して反発効果を示さない。

ニューロンの分化と維持

　En1、En2は中脳ドーパミンニューロンの維持に、細胞自律的に必要であり[78][104]、LINE-1の発現抑制を通じて、酸化ストレスから中脳ドーパミンニューロンを保護する[86][105]。また、En1は上オリーブ核ニューロンの、En1、En2は共に小脳核内側の一部の興奮性ニューロンおよび縫線核5-HTニューロンの分化と維持に必要である[79][80][106]。更に、En2は大脳基底核由来神経幹細胞からのGABA作動性ニューロンの分化に必要である[107]。加えて、En1およびEn2は培養海馬細胞の樹状突起の複雑度やシナプスに差次的に影響する[82]。

　マウス成体の脊髄のV1介在ニューロンで発現するEn1は、α運動ニューロンに対し傍分泌性の神経栄養活性を有する[108]。

疾患との関連

パーキンソン病

　En1+/-マウスあるいはEn1+/-; En2-/-マウスは、ヒトのパーキンソン病に類似したドーパミン作動性ニューロンの進行性喪失や運動障害を示す[105][109]。カニクイザルのパーキンソン病モデルの黒質緻密部へのEN1タンパク質の注入による治療効果が報告されている[110]。

自閉スペクトラム症

　EN2の多型と自閉スペクトラム症との関連は1995年に最初に示された[111]。EN2は患者で過剰発現する[112]。また、自閉スペクトラム症に関連するEN2のイントロン中の2つのSNPは、発現上昇に繋がる[113]。En2欠損マウスは患者と類似した行動、および学習の障害や、小脳の形態異常を示す[114]。また、患者において味覚異常が報告されているが、En2欠損マウスでも塩化ナトリウムへの嗜好性が強まる[115]。成人患者に対する慢性ストレスが、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型を増悪するかどうかは明らかで無いが、慢性的な環境ストレスに曝露したEn2欠損マウスでは、行動上の、あるいは神経解剖学的な表現型が増悪することが報告されている[116]。

統合失調症

　EN1のいくつかの単一塩基多型は統合失調症の症状および抗精神病薬の効果と関連する[117]。

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