「シナプス小胞」の版間の差分

[[image:シナプス小胞3.jpg|thumb|350px|'''図3．エキソサイトーシスの分子機構'''<br>A. アクティブゾーン(active zone)には、Munc13, Rim, CASTなどの巨大タンパク質が存在し、Munc18やSyntaxinと複合体を形成している。<br>B. SNARE複合体を形成するとComplexinが結合し、融合を阻害している。C→D. 細胞質にカルシウムが流入すると、Munc18やComplexinが解離し、SynaptotagminがCa²⁺センサーとして働く。E. 小胞膜と形質膜が融合した後のSNARE複合体はNSFとaSNAPの働きで解離する。]]

　シナプス小胞のエキソサイトーシスの特徴は、Ca²⁺によって迅速に制御される点が挙げられる。シナプス小胞に豊富に存在するタンパク質であるSynaptotagminは、PKCのCa²⁺結合部位と相同性を持つC2ドメインを有するCa²⁺結合タンパク質であると同時にリン脂質やSNAREタンパク質への結合能を有する膜タンパク質であり、シナプス小胞膜上のCa²⁺センサーの候補である<ref name=ref26><pubmed>    1589771</pubmed></ref>。Thomas Sudhofらは、Synaptotagmin 1ノックアウトマウス由来の神経培養細胞を解析した結果、活動電位に同期して起こる迅速なシナプス伝達が消失していることを見いだした。しかしながら、活動電位に同期しない遅いシナプス応答は依然として見られることから、Synaptotagminが速いシナプス小胞のエキソサイトーシスにおけるCa²⁺センサーであると考えられている<ref name=ref27><pubmed>7954835</pubmed></ref>。実際、Ca²⁺に対する親和性が低下するSynaptotagmin変異体のノックインマウスの[[海馬]]培養細胞では、小胞の放出確率が優位に有為に低下することが示されている<ref name=ref28><pubmed>11242035</pubmed></ref>。遅いエキソサイトーシスを担うCa²⁺センサーとして、他のSynaptotagminイソ型の関与が提唱されている<ref name=ref29><pubmed>24267651</pubmed></ref>。また、自発的エキソサイトーシスや遅いエキソサイトーシスに関わるCa²⁺センサーとしてCa²⁺親和性の高い可溶性Ca²⁺結合タンパク質であるDoc2の関与も示唆されている<ref name=ref30><pubmed>22036572</pubmed></ref> <ref name=ref31><pubmed>20150444</pubmed></ref>。

　Ca²⁺濃度の上昇後、極めて迅速にエキソサイトーシスが起こることを考えると、プライミングされたシナプス小胞において形成されたSNARE複合体が、Ca²⁺濃度の上昇が起こらない時には膜融合を引き起こさないように抑制している因子の存在が考えられる。この役割を果たしていると考えられているのがComplexinという小さな可溶性タンパク質である。ComplexinはSNAREタンパク質単独には結合せずSNARE複合体に高い親和性を有するタンパク質として知られている<ref name=ref32><pubmed>7553862</pubmed></ref>。現在のモデルでは、ComplexinがSNARE複合体に結合することで、v-SNAREとt-SNAREの複合体形成が不完全な状態で保たれており(clamped)、Ca²⁺濃度の上昇に伴いComplexinが複合体から解離し、そこにCa²⁺センサーであるSynaptotagminが複合体に入ることによりエキソサイトーシスが達成すると考えられている<ref name=ref33><pubmed>19164751</pubmed></ref> <ref name=ref34><pubmed>19164750</pubmed></ref>。

　エンドサイトーシスには、刺激頻度に応じて要する時間が異なる幾つかの仕組みが存在すると考えられている。比較的弱い刺激でエキソサイトーシスを起こした場合、クラスリン被覆に依存したエンドサイトーシスが1分以内で完了する（時定数15−20秒程度）。それに対して、1秒以内に完了する高速のエンドサイトーシスも観察されており、Kiss-and-Runと呼ばれている。また、強い連続刺激を与えた時には、エンドサイトーシスを支える分子機構が飽和するため、遅いエンドサイトーシスが起こる。この時、エキソサイトーシスで形質膜に挿入したシナプス小胞膜成分を回収するために、大きな膜構造の陥入像が見られるため、バルクエンドサイトーシスと名付けられている。クラスリン被覆依存的エンドサイトーシスの分子機構については、多くの研究により詳細が明らかになっているので、以下の（1）〜（6）に概説する<ref name=ref35><pubmed>22763746</pubmed></ref>（図4）。

　脂質膜とクラスリン被覆の結合を媒介するのが、AP-2やAP180などのアダプタータンパク質である。Stonin 2、epsinなどの関与も示唆されている。

　アダプタータンパク質タンパク質群にリクルートされる形でクラスリン被覆が集積し、球状のクラスリン被覆小胞が形成される。クラスリンは重鎖と軽鎖からなり三脚巴構造(Triskelion)を形成する。これが複数重合することによって格子を形成し、サッカーボール状のクラスリン被覆小胞が作られる。

　クラスリン被覆小胞が最終的に形質膜から分断される過程を司るのはDynaminというタンパク質である。Dynaminは[[GTP]]分解酵素活性をもち、GTPを加水分解する時のエネルギーを使って、立体構造を変化させることで膜の分断を行なうと考えられている。古くは[[ショウジョウバエ]]の温度感受性変異体であるshibireの変異遺伝子としてエンドサイトーシス過程における膜の最終的な分断に関わることが提唱されていた<ref name=ref4 />（上述）。一方、Dynamin 1ノックアウトマウスの研究から、Dynamin1がなくてもエンドサイトーシスが完全に損なわれるわけではないことが示された<ref name=ref36><pubmed>17463283</pubmed></ref>。電子顕微鏡像の三次元再構築を行なうと、Dynamin1ノックアウトマウスのシナプス前部には、出来かけのクラスリン被覆小胞が形質膜から伸びた管状の膜構造に房状に付着していると思われる様子が観察された。

　上記以外にもエンドサイトーシスに関わるとされるタンパク質が多く見つかっているが、その詳細な機能は未解明である。EndophilinやamphiphysinなどはBAR部位という特徴的な部位を持ち、膜に結合することで膜の歪曲を決定すると考えられている。例えばEndophilinは発見当初、クラスリン被覆小胞の形成が完了する際に、形質膜と小胞のつなぎ目のネック部分に集積して、ネックの直径を決めると考えられていた<ref name=ref37><pubmed>20059951</pubmed></ref>。また、EndophilinのC末端側がDynaminと直接結合することでDynaminをネック部分に集積させる役割が提唱されていた。しかしながら、Endophilin 1~3トリプルノックアウトマウスでは、予想されたクラスリン被覆小胞の形質膜での集積ではなく、シナプス前部細胞質におけるクラスリン被覆小胞の割合の増加が観察された<ref name=ref38><pubmed>22099461</pubmed></ref>。このことからEndophilinはクラスリン被覆小胞の形質膜からの分断以降のクラスリン被覆の脱落過程において重要な役割を果たしていることが明らかになった。その他にも脂質脱リン酸化酵素であるSynaptojaninを含め多くのタンパク質がエンドサイトーシスを制御していると考えられている。

　胎児期あるいは生誕直後の海馬や[[大脳皮質]]から神経細胞の分散培養を作成し、電気生理学的手法により後シナプス電流を検出することにより、シナプス前部での現象を類推することができる。胎生致死の遺伝子欠損マウスの場合でも、神経[[初代培養]]は作成できる場合が多いのが利点である。初期のシナプス小胞タンパク質の機能解析は、特に海馬由来のオータプス培養（1つの神経細胞が自分自身にシナプスを作る）が積極的に用いられた。神経培養細胞に遺伝子導入する方法も改良が重ねられ、遺伝子欠損の影響のみならず、レスキュー実験やタンパク質の構造−機能連関研究などに威力を発揮できる実験系である<ref name=ref27 /> <ref name=ref28 /> <ref name=ref39><pubmed>16682332</pubmed></ref>。

　哺乳類の脳幹部位に存在する聴覚系の中継シナプスである。その類い稀な大きさ故、脳幹スライス標本においてシナプス前部とシナプス後部から同時に[[パッチクランプ記録]]が可能である。また、シナプス前部側のガラス電極にシグナル分子を修飾する薬物や内在性タンパク質相互作用を修飾する抗体やペプチドを導入し、そのシナプス伝達に対する効果をシナプス後部側の応答で検証できる。更に、[[膜容量測定法]]を適用することで、エキソサイトーシスやエンドサイトーシスに伴う膜容量の変化を測定することも可能であり、シナプス前部の分子メカニズムを調べるための中枢神経系のモデル標本として用いられている<ref name=ref40><pubmed>16896951</pubmed></ref>。欠点としては、急性スライス標本であるため遺伝子の導入が困難であることや、胎生致死の遺伝子欠損マウスの解析が不可能であることが挙げられるが、近年、ウイルスベクターを利用してヘルドのカリックスシナプスに選択的に遺伝子導入する方法も開発されている<ref name=ref41><pubmed>19709630</pubmed></ref>。

　1990年代にWillam Betzらはスチリル色素(FM色素)を開発し、生きた細胞の[[細胞膜]]を蛍光標識することに成功した<ref name=ref42><pubmed>1553547</pubmed></ref> <ref name=ref43><pubmed>22194270</pubmed></ref>。FM色素は両親媒性の蛍光色素で、疎水性の部分が膜に侵入するが、親水性の部分があるために脂質二重膜の片側に留まる性質を持つ。また、膜に結合することで蛍光が数十倍〜100倍に上昇すること、膜への結合は可逆的であることも特徴である。これらの性質を利用すると、神経刺激依存的に形質膜からエンドサイトーシスされるシナプス小胞を蛍光標識できる。また、一度取り込まれたFM色素はエキソサイトーシスに伴い小胞から放出される性質を持つため、シナプス小胞のリサイクリングの特性を解析できるツールとしてしばしば用いられている。FM色素には、疎水性の異なるものが幾つかあり([[FM1-43]]、FM2-10)、疎水性の度合いにより膜への吸着や解離の特性が異なる。そのため、エンドサイトーシス時に標識されるシナプス小胞のプールに違いが見られ、またエキソサイトーシス時に解離する度合いが異なることから、シナプス小胞リサイクリングの多様な特性が明らかになってきた。

===pH感受性GFP（pHluorin）を用いたシナプス小胞リサイクリングの解析===

　[[緑色蛍光蛋白質]]([[GFP]])の蛍光強度は溶液のpHにより変化する。GFPの遺伝子に変異を加え蛍光強度のpH依存的変化を増幅させた変異体がpHluorinである<ref name=ref44><pubmed>9671304</pubmed></ref>。pHluorinは7.1程度のpKa値を示し、中性域では強い蛍光を発するが、弱酸性域では蛍光が減弱する。この蛍光変化は可逆的である。シナプス小胞内腔はV-ATPaseの働きにより弱酸性に保たれているため、pHluorinをシナプス小胞タンパク質の内腔側に融合させて遺伝子導入させると、小胞内腔に存在する時は蛍光を発せず、エキソサイトーシスに伴って細胞外の中性溶液に暴露された時に強い蛍光を発する。その後形質膜に移行したpHluorinを持つシナプス小胞タンパク質がエンドサイトーシスによって新たな小胞に回収されると、小胞内腔が酸性化され、再び蛍光が消失する。最初に用いられたSynaptobrevinに融合させたSynaptopHluorinは細胞表面への局在が多くシグナル−ノイズ比が低いことが問題となっていたが、その後SynaptophysinやVGLUT1の内腔側に融合させた改良版が作られ<ref name=ref45><pubmed>16982422</pubmed></ref> <ref name=ref46><pubmed>16815333</pubmed></ref>、1小胞イメージングなども可能となり、エンドサイトーシスや小胞酸性化の動態や速度論的解析が現在活発に進められている<ref name=ref47><pubmed>18077369</pubmed></ref>。ただし、厳密に言えばpHluorinを融合させたタンパク質の動態を観察しているのであり、小胞「膜」のエンドサイトーシスを直接観察している訳ではないことに留意する必要がある。

　中枢神経系シナプスの一部にはシナプス小胞よりも大きく(直径100~300ナノメートル)、電子顕微鏡で内腔が黒く見える大型[[有芯顆粒]]（Large Dense Core Vesicle: LDCV）が含まれるものがある（図5）。シナプス小胞はシナプス前部の形質膜形質膜近傍からクラスター状に多数存在するのに対して、LDCVはシナプス部位から離れた部位に散在している。シナプス小胞には速い神経伝達を担うグルタミン酸、GABA、グリシン、アセチルコリンが含まれているのに対して、LDCVには[[ドーパミン]]などのモノアミン類や[[神経ペプチド]]、多種多様な神経栄養因子を神経伝達物質として含まれている。また、交感神経のシナプスにおいては、[[ノルエピネフリン]]や[[セロトニン]]を含む60〜80 nmの[[有芯小胞]]が見られ、これをLDCVと区別してSDCV (small dense core vesicle) と呼ぶ場合もある。シナプス小胞とLDCVは中に含まれる神経伝達物質の違いに加え、様々な性質が異なる。シナプス小胞から放出される神経伝達物質神経伝達物質は、主にシナプス後部側の[[イオンチャネル]]型受容体に作用するため、シナプス後部側に電気的なシナプス応答を引き起こす。一方、LDCVに含まれる伝達物質はシナプス後部側のGタンパク共役型受容体や神経栄養因子受容体に作用し、セカンドメッセンジャーを介したシナプス伝達の修飾を行う。

　中枢神経系でのLDCVからの伝達物質放出機構は明らかではないが、クロム親和性細胞を用いた研究から、シナプス小胞同様、SNARE複合体による膜融合で伝達物質放出を行っていると考えられている。しかし、シナプス小胞とLDCVでは[[カルシウム]]に対する応答性に違いがあることが知られている。伝達物質放出のためにシナプス小胞がシナプス前部局所での高濃度のCa²⁺濃度上昇を必要とするのに対し、LDCVは持続的な低濃度のCa²⁺濃度上昇を必要とする<ref name=ref48><pubmed>15572159</pubmed></ref>。SNARE複合体に含まれるSynaptobrevinやCa²⁺センサーであるSynaptotagminなどにはアイソフォームがあり、シナプス小胞とLDCVに存在するこれらのアイソフォームが異なる可能性が示唆されている<ref name=ref49><pubmed>21551071</pubmed></ref> <ref name=ref50 />。またCa²⁺感受性タンパク質であるCAPSはLDCVにのみ存在する。シナプス小胞とLDCVはこれらのタンパク質の違いによってCa²⁺イオンの感受性やエキソサイトーシス・エンドサイトーシスの速度に相違が生まれるのかもしれないが、今後の研究による更なる解明が期待される。

　このようなシナプス活性帯からの距離的な差異や、活性化させる受容体の違い、また[[シナプス前膜]]と膜融合を起こすのに必要なカルシウムの応答性の相違などによって、LDCV内の伝達物質はシナプス小胞内の神経伝達物質よりも遅い速度でシナプス後部側に作用する。更に、シナプス小胞は伝達物質の放出後、エンドサイトーシスによって再合成され、シナプス前部局所で伝達物質の再充填が行われるのに対し、LDCVは一度きりの放出で、新たなLDCVはトランスゴルジネットワークから生成される、というように生成過程においても違いがある。シナプス前部にシナプス小胞とLDCVの両方が存在するシナプスが脳の各部位で見つかっている。そのようなシナプスではひとつの[[シナプス前終末]]に神経伝達物質を2種類以上有することになるが、この伝達物質の組み合わせは脳の部位によって異なり、 これがそれぞれのシナプスにおけるシナプス伝達の多様性に寄与していると考えられる<ref name=ref51><pubmed>    16847638</pubmed></ref>。