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→ソニック・ヘッジホッグシグナルを細胞レベルで解析する実験手法
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== ソニック・ヘッジホッグシグナルを細胞レベルで解析する実験手法 == | == ソニック・ヘッジホッグシグナルを細胞レベルで解析する実験手法 == | ||
細胞レベルでの解析においてShhシグナルに反応する細胞は少なく、よく使われるのはマウスの繊維芽細胞NIH3T3細胞<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> やヒト角化細胞<ref><pubmed>16880536</pubmed></ref> 、ニワトリやマウスの神経前駆細胞（[[胚性幹細胞]]から分化させたものや胚から単離したもの）である<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>25026549</pubmed></ref> 。Shhシグナルを受容する１次繊毛は、[[細胞周期]]のG0/G1期にのみ生じるため、特にNIH3T3でShhシグナルの実験を行う際にはあらかじめ血清飢餓状態にしてG0/G1期の細胞を多数得ることが重要である。細胞において実験的にShhシグナルを活性化する場合、大腸菌で作成した（つまりコレステロール修飾がされていない）リコンビナントタンパク質も活性は持っている<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>10564658</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。化合物としては、purmorphamineとSAGがSmoを標的とし<ref><pubmed>16408082</pubmed></ref> 、Shhのアゴニストとして用いられている。一方、cyclopamineとSANT-1は同じくSmoを標的とし、その活性を阻害することによりShhシグナルの[[アンタゴニスト]]として働くChen, 2002 #47;Dixit, 2013 #49}。 | 細胞レベルでの解析においてShhシグナルに反応する細胞は少なく、よく使われるのはマウスの繊維芽細胞NIH3T3細胞<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> やヒト角化細胞<ref><pubmed>16880536</pubmed></ref> 、ニワトリやマウスの神経前駆細胞（[[胚性幹細胞]]から分化させたものや胚から単離したもの）である<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>25026549</pubmed></ref> 。Shhシグナルを受容する１次繊毛は、[[細胞周期]]のG0/G1期にのみ生じるため、特にNIH3T3でShhシグナルの実験を行う際にはあらかじめ血清飢餓状態にしてG0/G1期の細胞を多数得ることが重要である。細胞において実験的にShhシグナルを活性化する場合、大腸菌で作成した（つまりコレステロール修飾がされていない）リコンビナントタンパク質も活性は持っている<ref><pubmed>26972603</pubmed></ref><ref><pubmed>10564658</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。化合物としては、purmorphamineとSAGがSmoを標的とし<ref><pubmed>16408082</pubmed></ref> 、Shhのアゴニストとして用いられている。一方、cyclopamineとSANT-1は同じくSmoを標的とし、その活性を阻害することによりShhシグナルの[[アンタゴニスト]]として働くChen, 2002 #47;Dixit, 2013 #49}。 | ||
Shhシグナルの強度を計測する方法としては、luciferaseまたはGFPのレポーターコンストラクトが多用され<ref><pubmed>9118802</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref> 、ほかの方法として、定量PCRを用いてShhシグナルのターゲット遺伝子であるGli1やPtc1の発現量を解析してもよい<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref><ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> 。NIH3T3では、Shhシグナルの添加時間とともにGli1やPtc1の発現量が増加する<ref><pubmed>25833741</pubmed></ref> 。一方、神経前駆細胞内ではShhシグナルは数時間以内にいったん活性化し、その後、負のフィードバックが起こって鎮静化する<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref><ref><pubmed>22265416</pubmed></ref><ref><pubmed>20532235</pubmed></ref> 。この負のフィードバックが起きるメカニズムとしては、Ptcが細胞膜上に多数存在するようになってShhタンパク質が枯渇するというもの<ref><pubmed>18046410</pubmed></ref> や、活性型Gliタンパク質が不活性型に比べて不安定であるというもの<ref><pubmed>20360384</pubmed></ref> などがあるが、全容はまだ明らかになっていない。 | |||
== ヘッジホッグ関連遺伝子と疾患 == | |||
ヘッジホッグシグナルが抑制される疾患については、その代表的なもののいくつか（ニーマン・ピック病、全前脳胞症）を前述したが、逆にヘッジホッグシグナルが亢進しすぎると髄芽種（medulloblastoma）という小児がんを引き起こすことが知られている<ref><pubmed>25150496</pubmed></ref> 。この疾患は元来放射線治療や外科的手術による腫瘍の除去しか治療法がなかったが、最近、Gタンパク質の一種Gαsを活性化させることによりShhシグナルをブロックする方法が検討されつつある<ref><pubmed>25150496</pubmed></ref> 。 | |||