「Dab1」の版間の差分

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　Dab1が神経細胞移動を制御する分子メカニズムについては、チロシンリン酸化Dab1に結合する分子を中心に解析が進められて来ている。特に''crk''と''crkl''のダブルノックアウトマウス<ref name="crk" />と''c3g''のジーントラップ系統マウス<ref name="c3g" />でリーラーフェノタイプが観察されることから、その下流分子として[[Rap1]]が注目された。Rap1は[[Rasファミリー低分子量Gタンパク質]]に属する[[低分子量Gタンパク質]]で、[[カドヘリン]]やインテグリンを介して細胞接着を制御する重要な分子であり、リーリンにより活性化されることが以前に報告されている<ref name="crk" />。
　Dab1が神経細胞移動を制御する分子メカニズムについては、チロシンリン酸化Dab1に結合する分子を中心に解析が進められて来ている。特に''crk''と''crkl''のダブルノックアウトマウス<ref name="crk" />と''c3g''のジーントラップ系統マウス<ref name="c3g" />でリーラーフェノタイプが観察されることから、その下流分子として[[Rap1]]が注目された。Rap1は[[Rasファミリー低分子量Gタンパク質]]に属する[[低分子量Gタンパク質]]で、[[カドヘリン]]やインテグリンを介して細胞接着を制御する重要な分子であり、リーリンにより活性化されることが以前に報告されている<ref name="crk" />。


　最近の報告により、リーリン-Dab1シグナルはCrk-C3G-Rap1経路を介して、ロコモーションの過程ではN-カドヘリンを制御し<ref name="ncad1" /><ref name="ncad2" />、ターミナルトランスロケーションの過程ではインテグリン&alpha;5&beta;1を介して神経細胞の移動過程をコントロールしていること<ref name="sekine2" />が示唆されているが、N-カドヘリンについてはRap1ではなく他の[[GDP-GTP交換因子]] ([[guanine nucleotide exchange factor]], [[GEF]])を介して機能制御している可能性が示唆されている<ref name="sekine2" />。インテグリンを介した神経細胞移動に関しては、インテグリン&alpha;3の関与も指摘されている<ref name="sanada" />。しかしながら、N-cadhelinを''dab1''ノックアウトマウスに導入するのみでは、神経細胞の移動がレスキューされないこと<ref name="ncad1" />、また、インテグリン&beta;1のノックアウトマウスやコンディショナルノックアウトマウスではリーラーフェノタイプにはならない<ref><pubmed>11516395</pubmed></ref><ref><pubmed>18077697</pubmed></ref>ことから、これらの働きは部分的である可能性が示唆されている。
　最近の研究では、早生まれのニューロン(胎生12.5日)のdab1をノックアウトした場合、あるいは、Rap1のGAPであるRap1GAPを強制発現させた場合両方で細胞体トランスロケーションが障害されること、Rap1GAPによる移動障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされること等から、リーリン-Dab1シグナルはRap1によるN-カドヘリンの活性化を介して、細胞体トランスロケーションの過程に関与している可能性が示唆されている。ただし、dab1の変異マウスにN-カドヘリンを導入するのみでは移動障害がレスキューされないことから、N-カドヘリン以外の分子の必要性が示されている。
　また、Rap1GAPを遅生まれのニューロン（胎生14.5日）に強制発現した場合、多極性移動からロコモーションへの変換が障害され、この障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされること。また、細胞内ドメインを欠いたVLDLRを強制発現すると、同様に多極性移動からロコモーションへの変換が阻害され、この異常は恒常的活性化型Rap1により部分的にレスキューされること等から、Reelin-Dab1シグナルは、遅生まれのニューロンに対しては、Rap1-N-カドヘリン経路を介して多極性移動からロコモーションへの変換を促進していることが示唆された。しかしながら、dab1のコンディショナルノックアウトマウスにおいては、多極性移動からロコモーションの過程は障害されないとの報告もあり、Reelin-Dab1シグナルの多極性移動からロコモーションへの変換への関与については更なる検証が必要であると思われる。
　これらの実験結果では、遅生まれのニューロンが脳表で行うターミナルトランスロケーションに関してReelinシグナルが関与しているかは不明であったが、リーリン受容体のノックダウンによって生じるターミナルトランスロケーション異常が、恒常的活性化型インテグリンの強制発現によりレスキューされることや、リーラーマウスでは脳表層でのインテグリンの活性化が見られないこと、Reelin刺激によってインテグリンのリガンドであるフィブロネクチンへの接着が促進されること等から、リーリンがDab1、C3G、Rap1を介してインテグリンの活性化を促進している可能性が示唆されている。また、Rap1のGAPの一つであるSpaIを弱いプロモーター活性を持つTa1あるいは強いプロモーターであるCAGで強制発現した場合、Ta1ではターミナルトランスロケーションが障害され、CAGでは中間帯からの移動が障害されていた。この結果より、Rap1には中間帯での移動と、ターミナルトランスロケーション、二つの異なる移動過程に関わっている可能性が示唆された。さらに、Rap1のGEFであるC3Gのdominant negative体を強制発現させた場合、ロコモーションはほとんど阻害されず、ターミナルトランスロケーションが主に障害されていた。これらの実験結果より、ロコモーションの過程ではRap1はC3G以外のGEFにより活性化され、ターミナルトランスロケーションの過程ではC3Gにより活性化される可能性が示唆されている。インテグリンについては、b1インテグリンのノックアウトマウスや、コンディショナルノックアウトマウスで、細胞移動には大きな異常がないことが示されていることから、何らかの分子がニューロンの移動に関して補償的に働いている可能性が示唆されている。
 


　また、Dab1のチロシンリン酸化非依存的にDab1に結合する分子として、[[Notch]]<ref name="notch"><pubmed>18957219</pubmed></ref>、[[Dab2IP]]<ref><pubmed>12877983</pubmed></ref>、[[N-WASP]]<ref><pubmed>15361067</pubmed></ref>が知られている。特にNotchについては、その活性化型フォームをリーラーマウスの移動神経細胞に導入した場合に神経細胞の移動をほぼ完全にレスキューすることから、リーリン-Dab1シグナルにおいて何らかの重要な役割を果たしていることが考えられるが、その作用メカニズムは不明である<ref name="notch" />。
　また、Dab1のチロシンリン酸化非依存的にDab1に結合する分子として、[[Notch]]<ref name="notch"><pubmed>18957219</pubmed></ref>、[[Dab2IP]]<ref><pubmed>12877983</pubmed></ref>、[[N-WASP]]<ref><pubmed>15361067</pubmed></ref>が知られている。特にNotchについては、その活性化型フォームをリーラーマウスの移動神経細胞に導入した場合に神経細胞の移動をほぼ完全にレスキューすることから、リーリン-Dab1シグナルにおいて何らかの重要な役割を果たしていることが考えられるが、その作用メカニズムは不明である<ref name="notch" />。
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== 参考文献  ==
== 参考文献  ==
<references />
<references />
（実験報告１）早生まれのニューロン(胎生12.5日)のdab1をノックアウトした場合、細胞体トランスロケーションが障害されること。また、Rap1のGAPであるRap1GAPを早生まれのニューロンに強制発現させた場合にも同様に細胞体トランスロケーションが障害されること。また、Rap1GAPによる移動障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされることから、細胞体トランスロケーションはReelin-Dab1-Rap1-N-カドヘリンという経路で制御されていることが示唆されている。
（実験報告２）Rap1GAPを遅生まれのニューロン（胎生14.5日）への強制発現すると、多極性移動からロコモーションへの変換が障害される。これはN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされる。また、Reelinシグナルを阻害すると想定される細胞内ドメインを欠いたVLDLRdeltaCを強制発現すると、同様に多極性移動からロコモーションへの変換を阻害すること。VLDLRdeltaCの強制発現による異常は、恒常的活性化型Rap1により部分的にレスキューされることから、Reelin-Dab1-Rap1-N-カドヘリン経路により、多極性移動からロコモーションへの変換促進されていることが示唆されている。
　一方、以下の報告によりリーリンシグナルがRap1を介してインテグリンの機能を制御している可能性が示唆された。
　Rap1のGAPの一つであるSpaIを弱いプロモーター活性を持つTa1あるいは強いプロモーターであるCAGで強制発現した場合、Ta1ではターミナルトランスロケーションが障害され、CAGでは中間帯からの移動が障害されていた。この結果より、Rap1には中間帯での移動と、ターミナルトランスロケーション、二つの異なる移動過程に関わっている可能性が示唆された。このSpaIの強制発現による異なる位置での移動障害であるが、中間帯での移動障害はN-カドヘリンの強制発現でレスキューされたが、ターミナルトランスロケーションはレスキューされなかったことから、ターミナルトランスロケーションはN-カドヘリンではなく、別の分子が移動を担っていることが示唆された。実際、Rap1の別のエフェクターであるインテグリンが、リーリンシグナルによって、活性化されターミナルトランスロケーションを制御している可能性が示された。
何故another GEFを想定しているかというと、dominant negative C3GではCPへのentryは阻害せずに、terminal translocationを阻害したから。
　SpaIはRap1のGAPの一つであるが、これを弱いプロモーター活性を持つTa1で発現させた場合には、ターミナルトランスロケーションが障害されるが、強いプロモーターであるCAGで発現させた場合には、Dab1 KDやDN-C3Gとは異なり、IMZの下方で止まっていた。CAG-SpaIのmigration異常はRap1aの強制発現により有意にレスキューされた。これらの結果より、Rap1はneuronal migrationにおいて二つの機能を持つことが示唆される。一つはCPより下の初期段階の移動過程、もう一つはターミナルトランスロケーションである。さらにTa1によるSpaIの弱い発現ではIMZでのmigrationを阻害しないことから、ターmナルトランスロケーションはIMZ内よりもっとRap1の機能に依存していることが示唆される。N-カドヘリンとCAG-SpaIの共発現は、CPへの神経細胞移動をレスキューしたが、terminal translocationはレスキューしなかった。これはN-カドヘリンとDN-C3Gの発現でも同じ結果になった。これらの結果より、ReelinはDAb1-Crk/CrkL-C3G経路を通じてRap1の機能を、PCZより下で、changeして、他のあるいはさらなるpathwayをterminal translocationやlayer formationの為に制御していることが想定された。
まとめると、
Francoは、Rap1-GAPを用いた実験で、E12.5EP->E16.5fixなので、somal translocationがRap1-N-cadのpathwayによって制御されていて、N-カドヘリンはleading prosessのアンアカリングに関与しているのではないか？という主張。もう少し遅い時期でターミナルトランスロケーションやロコモーションはどうか？というところは見ていない。
JossinはRap1GAPをE14.5にOEし、E17.5で観察した結果より、Rap1はmultipolar migrating zoneからのexitを制御していること、N-cadのcoexpressionによるrescueされることから、ここはN-cadが働いていること、VLDLR delta Cによるmigration異常がRap1CAによりrescueされることを示し、ReelinによりRap1が活性化され、N-カドヘリンがmembraneにリクルートされ、multipolarからbiporlarへの転換がおこるような論調になっている。
関根君はRap1のGAPの一つであるSpaIをTa1あるいはCAGでOEすると、Ta1ではterminal translocationが障害され、CAGではIMZからのmigrationが障害されていた結果より、Rap1にはIMZでのmigrationと、terminal translocationでのmigration、二つに関わっている可能性を示した。このSpaIによる二つ位置でのmigration異常は、下はN-cadのco-OEでレスキューされたが、上のはrescueされなかったので、また、DN-C3GとN-cadのco-expressionの場合もterminal translocationはrescuesされなかった。

2013年9月19日 (木) 11:10時点における版

本田 岳夫、仲嶋 一範
慶應義塾大学 医学部
DOI XXXX/XXXX　原稿受付日：2013年8月23日　原稿完成日：2013年月日
担当編集委員：大隅 典子（東北大学 大学院医学系研究科 附属創生応用医学研究センター 脳神経科学コアセンター 発生発達神経科学分野）

Disabled 1
Dab1のPTBドメインと、ApoER2細胞内ドメインの一部。Protein Data Bank 1NTV[1]による。
Identifiers
Symbol DAB1
External IDs OMIM: 603448 HomoloGene: 32084 GeneCards: DAB1 Gene
Orthologs
Species Human Mouse
Entrez 1600 13131
Ensembl ENSG00000173406 ENSMUSG00000028519
UniProt O75553 P97318
RefSeq (mRNA) NM_021080.3 NM_010014.2
RefSeq (protein) NP_066566.3 NP_034144.1
Location (UCSC) Chr 1:
57.46 – 59.01 Mb		 Chr 4:
103.62 – 104.74 Mb
PubMed search [1] [2]


英語名: disabled 1、Dab1 遺伝子名: disabled homolog 1(ヒト)、disabled 1 (マウス)、遺伝子シンボル：Dab1 (ヒト)、DAB1 (マウス)

　Dab1は中枢神経系において神経細胞の正常な移動・配置に必須の細胞内アダプター分子で、神経細胞の樹状突起の発達等にも関与していると考えられている[2][3]。dab1遺伝子の欠損は層構造を形成する大脳新皮質、海馬、小脳、あるいは核構造を形成する脳幹、脊髄等の神経細胞の配置に異常を引き起こす。同様な表現型は、reelin（リーリン遺伝子に変異のあるreelerマウスと、low density lipoprotein receptor-related protein 8 (apoER2)とvery-low-density-lipoprotein receptor (vldlr)のダブルノックアウトマウスでも観察されている。様々な実験結果により、細胞外のリーリンがApoER2/VLDLRにより受容され、Dab1が細胞内でシグナルを伝達するシグナル伝達経路を形成していると考えられている。また、リーリン刺激によってリン酸化を受けるDab1のチロシン5所をフェニルアラニンに変異させたマウスでは、dab1遺伝子の変異と同じ神経細胞の配置異常が引き起こされることから、Dab1のチロシンリン酸化はこのシグナル伝達経路に必須であることが示されている。チロシンリン酸化されたDab1により活性化される経路が調べられ、中でもCrk/CrkL-Rap1経路が、N-カドヘリン（N-cadherin）やインテグリンα5β1（Integrin α5β1)の制御を行うことで神経細胞の移動調節を行っている可能性が示唆されている。

歴史的推移

（編集　コメント　イントロが長目なので、発見の歴史までとして、最近の内容は「機能」の所に移して頂けないでしょうか。）

　1997年、チロシンキナーゼSrcに結合するタンパク質が探索され、当時未知のタンパク質であった、Disabled 1 (Dab1)（ショウジョウバエで同定されていたdisabled-1遺伝子と相同性があった為命名）が同定された[4]。Dab1はN末端にPhosphotyrosine-binding domain (PTBドメイン)を持つアダプタータンパク質で、Srcによりリン酸化されることが明らかになった[4]。dab1ノックアウトマウスが作成された所、大脳新皮質、海馬、小脳において神経細胞の配置異常が観察された[5]。この表現型は1951年に報告されその原因遺伝子リーリンが1995年に報告されたリーラー（reeler）マウスの表現型（リーラー表現型）[6]と酷似していた。さらに、リーラー表現型を示すことが知られていたyotariマウスとscramblerマウスの原因遺伝子がdab1であることが明らかになり[7][8][9][10]、Dab1とリーリンとの関連性が示唆された。

　実際、リーラーマウスでは、

  1. dab1のmRNA量は変化しないが、タンパク質量が上昇していること、[11]、
  2. リーリンは大脳皮質表層（辺縁帯）に分布するカハールレチウス細胞（Cajal-Retzius cell）に主に発現が観察されるが、Dab1はそれに隣接する神経細胞に発現が観察され、相補的な発現パターンになっていること[11]、
  3. リーリン刺激によりDab1のチロシンリン酸化が観察されること[12]

等から、Dab1は細胞内でリーリンシグナルを伝達する役割を果たしているのではないかと推測された。

　2000年になり、ApoER2とVLDLRのダブルノックアウトマウスが、リーラーフェノタイプになること[13]が明らかになり、さらに生化学的結合実験等により、ApoER2とVLDLRがリーリンのレセプターであることが示された[14][15]。またApoER2とVLDLRの細胞内ドメインのNPxYモチーフには、Dab1がそのPTBドメインを介して結合出来る事が示され、Dab1はApoER2、VLDLRを介してリーリンシグナルを受け取る事が示唆された[13]。

　また同年、活性化型Srcによってチロシンリン酸化を受ける可能性のある5つのチロシンが同定され、この5つのチロシンリン酸化部位全てをフェニルアラニンに変異させたノックインマウスが、リーラーフェノタイプになる事が示された[16]。この実験結果により、Dab1のチロシンリン酸化はリーリンシグナルにとって必須であることが示された。

　2003年以降、チロシンリン酸化されたDab1に結合する様々なタンパク質が報告され、現在までにPhosphoinositide 3-kinase (PI3K)[17]、SOCS3[18]、NCKβ[19]、Lis1[20]、Src family kinase[4][21]、Crkファミリータンパク質（Crk、CrkL）[22][23][24]がDab1のチロシンリン酸化依存的に結合することが報告されている。このうちcrkとcrklのダブルノックアウトマウス[22]、c3gのジーントラップ系統マウス[25]、及びsrcとfynのダブルノックアウトマウス[26]においてはリーラーフェノタイプ様の異常が生じることが報告されている。

　2004年には、dab1欠損マウスの海馬歯状回の顆粒細胞の樹状突起が野生型に比べて減少していること[27]、dab1欠損マウス由来の海馬神経細胞を培養した場合でも、樹状突起が短くなり、枝分かれの数も減少すること[27]が報告された。また、2006年、dab1のノックダウン実験により、神経細胞の樹状突起形成が阻害されること[28]、さらに、生後時期特異的にdab1をノックアウトした場合、海馬の樹状突起形成が阻害される[29]ことが報告され、Dab1は神経細胞の移動過程以外にも、樹状突起の発達にも関与することが示唆された。

　2011年以降には、それまでの観察で培養神経細胞をリーリン刺激すると、Dab1のリン酸化を介してCrk-C3G-Rap1経路を活性化することが報告されていた[22]為、Rap1のエフェクター分子が調べられた。その結果、リーリン-Dab1シグナルはN-カドヘリンを介して神経細胞のロコモーションと呼ばれる移動過程[30][31]に、インテグリンα5β1を介してターミナルトランスロケーションと呼ばれる移動過程に関与している[32]可能性が示唆された。

構造

図1．Dab1のドメイン構造
p80とp45はDab1の二つのスプライスバリアントである。オレンジ色の領域がPhosphotyrosine-binding (PTB)ドメイン、赤色の領域が核移行シグナル（Nuclear Localization Signal (NLS)）、青色の領域が核外移行シグナル（Nuclear Export Signal(NES)）、Yが主なチロシンリン酸化部位を示す。p45の灰色部分はp45特有の配列を示す。

ドメイン構造

　マウスでは選択的スプライシングにより13種のスプライスバリアントが存在することが報告されている[22]が、発達過程の中枢神経系では555アミノ酸を持つスプライスバリアントであるdab1 p80（図1、p80）が最も多く発現している[4]。

　Dab1(p80)はN末端側にPTBドメイン、続く領域にチロシンリン酸化部位を持つ細胞内タンパク質である（図1）。PTBドメインは、細胞内ドメインにNPxYモチーフを持つ膜タンパク質と結合する。これまでに、ApoER2[13]、VLDLR[13]、Pcdh18[4]（Pcdh18の場合はNPTS配列を持つ）、アミロイド前駆タンパク質 (Amyloid precursor proteinAPP)[13]、Amyloid-like protein 1 (APLP1)[13]、 Amyloid-like protein 2 (APLP2)[33]との結合が報告されている。これらの結合にはNPxYモチーフのチロシン残基のリン酸化は必要としない。PTBドメインにはplekstrin homology (PH)ドメイン様構造が含まれており、リン脂質（ホスファチジルイノシトール-4-リン酸 (PI(4)P)とホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (PI(4,5)P)）に結合することが出来る[34]。また、PTBドメインのN末端側には核移行シグナル(Nuclear localization Signal: NLS)、PTBドメインのC末端側に二つの核外移行シグナル(Nuclear Export Signal: NES)を持っており、核と細胞質間を移行する能力を有している[35]。

　また、dab1のp45スプライスバリアント（図1、p45）がコードするタンパク質は、p80とN末端側の1番目〜241番目のアミノ酸までが共通で、そのC末端側は異なる配列を有している。p45のみを発現するノックインマウスが作成されたが、リーラーフェノタイプは示さないことから、中枢神経系の正常発生については、p45に含まれないp80のC末端側の部位は必須では無いことが示されている[36]。

リン酸化

　PTBドメインのC末端側、分子の中程にチロシンリン酸化を受ける部位が５カ所（Y185、Y198、Y200、Y220、Y232）同定されており[16]、このうちのY200以外の4つが特にシグナルの伝達に重要な役割を果たしている事が明らかにされている[37][38]。4つのチロシンリン酸化部位は配列の相同性からYQXI配列を持つ2つ(Y185、Y198）とYXVP配列を持つ二つ（Y220、Y232）に分けられる。 神経細胞の移動に関しては、YQXI配列を持つY185とY198の間、およびYXVP配列を持つY220とY232の間で機能に冗長性を持つ。一方、両方の対立遺伝子にY185・Y198両方に変異を持つマウスと、Y220・Y232両方に変異を持つマウスではそれぞれリーラーフェノタイプを示す。しかしながら、片方の対立遺伝子でY185・Y198両方に変異を持ち、もう一方の対立遺伝子でY220・Y232両方に変異を持つ変異マウスではリーラーフェノタイプを示さないことから、YQXI配列を持つY185・Y198とYXVP配列を持つY220・Y232はそれぞれ独立の機能を持ち、さらにYQXI配列とYXVP配列間で相互依存する関係であることが示されている[37]。Y200の生理的役割は不明である。

サブファミリー

　哺乳類ではDab2が存在しており、細胞表面分子のターンオーバー、エンドサイトーシス等に関与していると考えられている。

発現

　In situハイブリダイゼーションにより、dab1 mRNAの発現分布を調べた報告[39]によると、発生期のマウス大脳新皮質では、胎生11.5日目の神経上皮細胞に弱く発現が観察される。胎生12.5日目には皮質板（cortical plate:CP)での強い発現が顕著になり、脳室帯（ventricular zone:VZ）での弱い発現も引き続き観察される。その後、生後0日にかけて、強い皮質板での発現が維持されるが、脳室帯での発現は弱くなり、中間帯（intermediate zone:IMZ）の上部で弱い発現が観察されるようになる。成獣のマウスでも生後0日に比べて弱くはなるが、皮質板において発現が観察される。大脳新皮質では、Dab1の発現部位はリーリンを発現しているカハールレチウス細胞が存在する辺縁帯（marginal zone:MZ）と相互排他的なパターンになっている。

　海馬では妊娠12.5日目には神経上皮細胞に弱くdab1のmRNAが観察され、妊娠14.5日目までに海馬の辺縁帯、錐体細胞層、脳室帯の三層が別れ、錐体細胞層に強い発現が観察されるようになる。また隣り合う歯状回の顆粒細胞層にもdab1の発現が観察される。海馬についてもdab1の発現は生後3日でも維持される。また、大脳新皮質と同様、Dab1の発現領域はリーリンを発現するカハールレチウス細胞の存在する辺縁帯に隣接した領域で観察される。

　小脳については、妊娠13.5日目には脳室帯と外顆粒層の間の幼弱プルキンエ細胞群に発現が見られ、妊娠18.5日目から生後3日では、プルキンエ細胞層で発現が観察される。リーリンを強く発現する顆粒細胞が存在する外顆粒層に隣接してdab1を発現するプルキンエ細胞層が存在し、小脳においても相補的な発現パターンを示す。

　Dab1のタンパク質がどの細胞にどのような細胞内分布で局在しているのかは、免疫組織化学染色が難しく報告は少ないが、mRNAの発現分布と一致して大脳新皮質では神経細胞[40][41]、小脳ではプルキンエ細胞[42]に発現していることが報告されている。また、生体内における詳細な細胞内分布については不明である。

BGEM http://www.stjudebgem.org/web/view/probe/viewProbeDetails.php?id=1

ALLEN http://developingmouse.brain-map.org/data/search/gene/index.html?term=dab1

機能

　前述の通り、"dab1"のノックアウトマウス及び、自然発症突然変異マウスで、大脳新皮質、海馬、小脳、脳幹、脊髄等の神経細胞の移動が障害されていることから、Dab1は層構造・核構造を形成する神経細胞移動において大変重要な役割を担っていると考えられている。他の組織・臓器における機能については少数の報告があるのみで、あまりよくわかっていない。

大脳新皮質神経発生における機能

欠損による異常

図2．大脳新皮質の正常発生とリーリン、dab1変異マウス、apoER2/vldlr ダブルノックアウトマウスの発生異常
(A) 発生期のマウス脳の模式図。下図は上図の点線部分で冠状断にした際の断面図。薄い赤色部分を拡大した図をBとCに示す。(B, C) 野生型 (B)、または reeler、yotari, scramblerマウス、及び"dab1"ノックアウトマウスと apoer2/vldlrダブルノックアウトマウス (C)の大脳新皮質の発生過程を示す。脳の表面は上方向、脳室側は下方向。数字は野生型マウスで配置される予定の層を示す。RG: 放射状グリア細胞 (radial glia cell)、PP: プレプレート (preplate)、VZ: 脳室帯（ventricular zone)、CR: カハールレチウス細胞（Cajal-Retzius cell)、SP: サブプレート(subplate)神経細胞、MZ: 辺縁帯（marginal zone)、CP: 皮質板 (cortical plate)、SPP:スーパープレート(super plate)、IPZ: 内網状帯(internal plexiform zone)

　上記のように、大脳新皮質の神経細胞は脳室近くで誕生後、脳の表面方向に放射状に移動し、最初期に誕生した神経細胞で形成されるプレプレートと呼ばれる細胞層の間に入り込んで、これをカハールレチウス細胞を含む辺縁帯とサブプレートと呼ばれる二つの層に分離する（プレプレートスプリッティング）（図2B, iからii）。神経細胞は辺縁帯の直下で移動を終了し、樹状突起を発達させて最終分化を行なう。神経細胞は次々に脳室帯で誕生して脳表面方向に移動するが、誕生時期の遅い神経細胞は誕生時期の早い神経細胞を追い越し、より脳の表層側に配置されるようになる（図2B, iii）。この細胞配置の仕組みは“インサイドアウト”様式と呼ばれ、哺乳類の大脳新皮質でのみ観察される特徴的な組織構築様式である。

　dab1欠損マウスでは神経細胞は正常に産生されるが、神経細胞はプレプレートの間に入って分割することが出来ず、プレプレートスプリッティングが起らない。また、肉眼的に同定出来る辺縁帯が形成されず、皮質板を構成する神経細胞が脳表面近くまで分布する。後続の神経細胞は正常に移動出来ずに、脳表面から脳室方向に異所性に配置され、“アウトサイドイン”と呼ばれる異常な組織構築を行うようになり、全体として層構造が逆転する異常な大脳新皮質が形成される。異常な構造中には、内網状帯（internal plexiform zone）と呼ばれる細胞密度の低い領域が散在し、神経細胞の樹状突起がこの領域に向かい展開される傾向がある[43]。

分子機能

　dab1欠損により引き起こされるこれらの神経細胞の移動障害が、dab1が欠損した細胞自身の障害によるものなのか、あるいは、dab1を欠損した周囲の細胞によって引き起こされた二次的な原因によるものなのか、あるいは両方なのか、Dab1の機能を解明する上で焦点となった。この問題を解決するため、野生型dab1を発現する細胞とdab1を欠損した細胞のキメラマウスが作成された[44]。その結果、野生型のdab1を発現する細胞群がdab1を欠損した細胞群の上に配置されるような異常な皮質構造（スーパー皮質）が形成される一方、少数の野生型細胞がdab1欠損細胞群中に取り込まれることが示された。この結果より、dab1欠損による細胞の移動障害は主には細胞内因性の障害によって引き起こされているが、一部は周囲の細胞の障害にも影響されていることが示唆された。

　また、dab1を欠損したscramblerマウスやyotariマウスにdab1をレトロウイルスやin utero エレクトロポレーション法により導入し、dab1の発現をレスキューした場合においても、dab1を導入された神経細胞はdab1を欠損した神経細胞を追い越して脳表層まで到達し[45][38]、プレプレートスプリッティングも引き起こす[38]ことから、dab1欠損による移動障害が主には細胞内在性に引き起こされていることが示唆されている。

　では、dab1の欠損により、何が一次的に障害されているのか？この問題を解明する為に、周囲の細胞が正常な環境下で、一部の神経細胞でのみDab1の機能を阻害し、dab1の欠損によりどのような移動障害が引き起こされるのかが詳細に観察された。大脳新皮質の神経細胞は誕生時期の違いにより、異なる移動過程を経ることが知られている[46]。早生まれの神経細胞は脳室帯で誕生した後、もともと脳の表層にアンカリングしてあった突起を用いて細胞体を引き上げる、細胞体トランスロケーション（somal translocation）と呼ばれる形式で移動する[47]。一方、遅生まれの神経細胞の多くは、脳室帯で誕生した後、その直上で多極性の形態（多極性細胞）をとって突起を繰り返し伸縮する多極性移動（multipolar migration）と呼ばれる移動を行い、その後、紡錘形の形態にトランスフォームして脳表面にロコモーション(locomotion)と呼ばれる方式で移動する[48]。さらに、脳表面付近では神経細胞の進行方向に長く伸びた先導突起（leading process）の先端が辺縁帯に届くと、細胞体は放射状グリア線維から離れ、先導突起が先端をアンカリングしたまま短縮して細胞体を引き上げる様に移動するターミナルトランスロケーションと呼ばれる移動様式により移動を行う[49]。

　In uteroエレクトロポレーションによって移動神経細胞のdab1のノックダウンが行われた結果、神経細胞は脳の表層近くまで移動するが、移動の最終過程であるターミナルトランスロケーションが障害されることがわかった[28][50][51]。さらに、Dab1依存的に神経細胞がターミナルトランスロケーションを始める部位は、移動を終えたばかりの未成熟神経細胞が辺縁帯直下で密に集まった領域である原始皮質帯 (primitive cortical zone:PCZ) の下端近くであることが示されている[50]。また、dab1のコンディショナルノックアウトマウスを用い、in uteroエレクトロポレーションにより一部の細胞でdab1をノックアウトした実験では、早生まれの細胞では細胞体トランスロケーションが阻害され、遅生まれの細胞ではターミナルトランスロケーションが阻害されていることが示された[31]。一方、これらの実験では樹状突起形成にも異常が生じる結果が報告されているが、ターミナルトランスロケーションも阻害されていることから、樹状突起形成の発達障害は二次的な影響との可能性も考えられる。

　しかしながら、海馬において生後3日に時期特異的にdab1をノックアウトした場合に、樹状突起形成に異常が生じること[29]、dab1ノックアウトマウスから得られた神経細胞を培養した場合にも樹状突起の形成に障害が生じること[27]等から、dab1には樹状突起形成を促進する働きがあることが示唆されている。

図3．大脳新皮質層形成時におけるDab1を介するシグナル伝達系の模式図
主にカハールレチウス細胞から分泌されたリーリンは移動神経細胞に発現するApoER2やVLDLRに結合し、FynあるいはSrc等のSrcファミリーチロシンキナーゼの活性化により、Dab1をリン酸化する。リン酸化されたDab1にはPI3K, SOCS3, Nckβ, Crk等が結合する。Crkの下流でC3GがRap1をGDP結合型からGTP結合型に変換し、活性化されたRap1はインテグリンα5β1の活性を制御すると考えられている（青線で示された経路）。一方、N-カドヘリンについては、他のGEFを介したRap1の活性化によって機能制御を受けている可能性が示唆されている（緑線の経路）。NotchとDab1の結合にDab1のリン酸化が必要かは明らかになっていない。

シグナル伝達機構

　Dab1が神経細胞移動を制御する分子メカニズムについては、チロシンリン酸化Dab1に結合する分子を中心に解析が進められて来ている。特にcrkとcrklのダブルノックアウトマウス[22]とc3gのジーントラップ系統マウス[25]でリーラーフェノタイプが観察されることから、その下流分子としてRap1が注目された。Rap1はRasファミリー低分子量Gタンパク質に属する低分子量Gタンパク質で、カドヘリンやインテグリンを介して細胞接着を制御する重要な分子であり、リーリンにより活性化されることが以前に報告されている[22]。

　最近の研究では、早生まれのニューロン(胎生12.5日)のdab1をノックアウトした場合、あるいは、Rap1のGAPであるRap1GAPを強制発現させた場合両方で細胞体トランスロケーションが障害されること、Rap1GAPによる移動障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされること等から、リーリン-Dab1シグナルはRap1によるN-カドヘリンの活性化を介して、細胞体トランスロケーションの過程に関与している可能性が示唆されている。ただし、dab1の変異マウスにN-カドヘリンを導入するのみでは移動障害がレスキューされないことから、N-カドヘリン以外の分子の必要性が示されている。 　また、Rap1GAPを遅生まれのニューロン（胎生14.5日）に強制発現した場合、多極性移動からロコモーションへの変換が障害され、この障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされること。また、細胞内ドメインを欠いたVLDLRを強制発現すると、同様に多極性移動からロコモーションへの変換が阻害され、この異常は恒常的活性化型Rap1により部分的にレスキューされること等から、Reelin-Dab1シグナルは、遅生まれのニューロンに対しては、Rap1-N-カドヘリン経路を介して多極性移動からロコモーションへの変換を促進していることが示唆された。しかしながら、dab1のコンディショナルノックアウトマウスにおいては、多極性移動からロコモーションの過程は障害されないとの報告もあり、Reelin-Dab1シグナルの多極性移動からロコモーションへの変換への関与については更なる検証が必要であると思われる。 　これらの実験結果では、遅生まれのニューロンが脳表で行うターミナルトランスロケーションに関してReelinシグナルが関与しているかは不明であったが、リーリン受容体のノックダウンによって生じるターミナルトランスロケーション異常が、恒常的活性化型インテグリンの強制発現によりレスキューされることや、リーラーマウスでは脳表層でのインテグリンの活性化が見られないこと、Reelin刺激によってインテグリンのリガンドであるフィブロネクチンへの接着が促進されること等から、リーリンがDab1、C3G、Rap1を介してインテグリンの活性化を促進している可能性が示唆されている。また、Rap1のGAPの一つであるSpaIを弱いプロモーター活性を持つTa1あるいは強いプロモーターであるCAGで強制発現した場合、Ta1ではターミナルトランスロケーションが障害され、CAGでは中間帯からの移動が障害されていた。この結果より、Rap1には中間帯での移動と、ターミナルトランスロケーション、二つの異なる移動過程に関わっている可能性が示唆された。さらに、Rap1のGEFであるC3Gのdominant negative体を強制発現させた場合、ロコモーションはほとんど阻害されず、ターミナルトランスロケーションが主に障害されていた。これらの実験結果より、ロコモーションの過程ではRap1はC3G以外のGEFにより活性化され、ターミナルトランスロケーションの過程ではC3Gにより活性化される可能性が示唆されている。インテグリンについては、b1インテグリンのノックアウトマウスや、コンディショナルノックアウトマウスで、細胞移動には大きな異常がないことが示されていることから、何らかの分子がニューロンの移動に関して補償的に働いている可能性が示唆されている。


　また、Dab1のチロシンリン酸化非依存的にDab1に結合する分子として、Notch[52]、Dab2IP[53]、N-WASP[54]が知られている。特にNotchについては、その活性化型フォームをリーラーマウスの移動神経細胞に導入した場合に神経細胞の移動をほぼ完全にレスキューすることから、リーリン-Dab1シグナルにおいて何らかの重要な役割を果たしていることが考えられるが、その作用メカニズムは不明である[52]。

制約上、引用出来なかった多くの関連論文があることをお詫び致します。

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（実験報告１）早生まれのニューロン(胎生12.5日)のdab1をノックアウトした場合、細胞体トランスロケーションが障害されること。また、Rap1のGAPであるRap1GAPを早生まれのニューロンに強制発現させた場合にも同様に細胞体トランスロケーションが障害されること。また、Rap1GAPによる移動障害がN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされることから、細胞体トランスロケーションはReelin-Dab1-Rap1-N-カドヘリンという経路で制御されていることが示唆されている。

（実験報告２）Rap1GAPを遅生まれのニューロン（胎生14.5日）への強制発現すると、多極性移動からロコモーションへの変換が障害される。これはN-カドヘリンの強制発現により、レスキューされる。また、Reelinシグナルを阻害すると想定される細胞内ドメインを欠いたVLDLRdeltaCを強制発現すると、同様に多極性移動からロコモーションへの変換を阻害すること。VLDLRdeltaCの強制発現による異常は、恒常的活性化型Rap1により部分的にレスキューされることから、Reelin-Dab1-Rap1-N-カドヘリン経路により、多極性移動からロコモーションへの変換促進されていることが示唆されている。

　一方、以下の報告によりリーリンシグナルがRap1を介してインテグリンの機能を制御している可能性が示唆された。 　Rap1のGAPの一つであるSpaIを弱いプロモーター活性を持つTa1あるいは強いプロモーターであるCAGで強制発現した場合、Ta1ではターミナルトランスロケーションが障害され、CAGでは中間帯からの移動が障害されていた。この結果より、Rap1には中間帯での移動と、ターミナルトランスロケーション、二つの異なる移動過程に関わっている可能性が示唆された。このSpaIの強制発現による異なる位置での移動障害であるが、中間帯での移動障害はN-カドヘリンの強制発現でレスキューされたが、ターミナルトランスロケーションはレスキューされなかったことから、ターミナルトランスロケーションはN-カドヘリンではなく、別の分子が移動を担っていることが示唆された。実際、Rap1の別のエフェクターであるインテグリンが、リーリンシグナルによって、活性化されターミナルトランスロケーションを制御している可能性が示された。

何故another GEFを想定しているかというと、dominant negative C3GではCPへのentryは阻害せずに、terminal translocationを阻害したから。


　SpaIはRap1のGAPの一つであるが、これを弱いプロモーター活性を持つTa1で発現させた場合には、ターミナルトランスロケーションが障害されるが、強いプロモーターであるCAGで発現させた場合には、Dab1 KDやDN-C3Gとは異なり、IMZの下方で止まっていた。CAG-SpaIのmigration異常はRap1aの強制発現により有意にレスキューされた。これらの結果より、Rap1はneuronal migrationにおいて二つの機能を持つことが示唆される。一つはCPより下の初期段階の移動過程、もう一つはターミナルトランスロケーションである。さらにTa1によるSpaIの弱い発現ではIMZでのmigrationを阻害しないことから、ターmナルトランスロケーションはIMZ内よりもっとRap1の機能に依存していることが示唆される。N-カドヘリンとCAG-SpaIの共発現は、CPへの神経細胞移動をレスキューしたが、terminal translocationはレスキューしなかった。これはN-カドヘリンとDN-C3Gの発現でも同じ結果になった。これらの結果より、ReelinはDAb1-Crk/CrkL-C3G経路を通じてRap1の機能を、PCZより下で、changeして、他のあるいはさらなるpathwayをterminal translocationやlayer formationの為に制御していることが想定された。

まとめると、 Francoは、Rap1-GAPを用いた実験で、E12.5EP->E16.5fixなので、somal translocationがRap1-N-cadのpathwayによって制御されていて、N-カドヘリンはleading prosessのアンアカリングに関与しているのではないか？という主張。もう少し遅い時期でターミナルトランスロケーションやロコモーションはどうか？というところは見ていない。

JossinはRap1GAPをE14.5にOEし、E17.5で観察した結果より、Rap1はmultipolar migrating zoneからのexitを制御していること、N-cadのcoexpressionによるrescueされることから、ここはN-cadが働いていること、VLDLR delta Cによるmigration異常がRap1CAによりrescueされることを示し、ReelinによりRap1が活性化され、N-カドヘリンがmembraneにリクルートされ、multipolarからbiporlarへの転換がおこるような論調になっている。

関根君はRap1のGAPの一つであるSpaIをTa1あるいはCAGでOEすると、Ta1ではterminal translocationが障害され、CAGではIMZからのmigrationが障害されていた結果より、Rap1にはIMZでのmigrationと、terminal translocationでのmigration、二つに関わっている可能性を示した。このSpaIによる二つ位置でのmigration異常は、下はN-cadのco-OEでレスキューされたが、上のはrescueされなかったので、また、DN-C3GとN-cadのco-expressionの場合もterminal translocationはrescuesされなかった。

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